Circulation: 靶向鞘氨醇-1-磷酸信号通路以防止主动脉瓣疾病的进展

Benkhoff, M. et al. Targeting Sphingosine-1-Phosphate Signaling to Prevent the Progression of Aortic Valve Disease. Circulation (2024) doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.123.067270.

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引言

流行病学 （社会医疗负担）

AVD是西方国家最常见的瓣膜性心脏病，尤其在老年人群中：

• 高患病率：随着人口老龄化，未来20年内患病率预计翻倍。
• 高死亡率：即使轻中度AVD也与更高的死亡率相关，严重病例的3年内死亡率接近50%。
• 生活质量：AVD显著降低患者的生活质量，并增加医疗负担。

现有治疗的局限性：

• 当前唯一的治疗手段是瓣膜置换（手术或介入），适用于晚期病变。
• 缺乏有效的药物可以延缓或预防疾病进展。

目前AVD病理生理机制的研究进展

AVD的病理过程：

• 机械损伤和炎症启动病变：

  • 高血压和剪切应力异常引发主动脉瓣的机械损伤；
  • 内皮功能障碍导致脂质沉积和炎症激活。

• 病理过程以瓣膜钙化为核心，形成“恶性循环”：

  • 细胞水平：瓣膜间质细胞（VICs）经历成骨分化，导致骨样结构形成。
  • 力学反馈：瓣膜钙化导致瓣膜僵硬和压力增加，进一步加重钙化。

• 信号通路：

  • 涉及RANK/RANKL/OPG、Wnt/GSK3β/β-catenin和Notch信号等。
  • 这些通路控制成骨转录因子RUNX2和骨形态发生蛋白（BMP-2）的表达。

S1P在钙化中的作用未知：

• 已知S1P（鞘氨醇-1-磷酸）在骨质代谢中具有重要作用：

  • 促进成骨细胞的增殖、分化和矿化；
  • 增强机械应力下的S1P生成。

• 然而，S1P在主动脉瓣间质细胞中的作用，以及其是否与AVD的钙化和病程进展相关，尚不清楚。

本文的研究目标：

• 探讨S1P信号在主动脉瓣疾病中的病理作用；
• 验证靶向S1P信号通路是否能够阻止或减缓AVD的进展。

本文的主要结果

1. S1P水平对AVD进展的影响

实验设计：

• 高S1P组：使用S1P裂解酶抑制剂DOP提高小鼠体内S1P浓度。
• 低S1P组：通过基因敲除SphK1（S1P生成的关键酶）降低S1P水平。
• 测量指标：心超：瓣膜峰值速度（AV Peak Velocity）、瓣膜平均压力梯度（AV Mean Pressure Gradient）、瓣膜厚度及心脏射血分数（EF）。组织学：茜素红（ARS） 染色

图表内容与解析：

1. 高S1P组（腹腔注射 DOP） ：

   • 图1A和1B显示，DOP处理后，小鼠瓣膜峰值速度和压力梯度显著增加，表明AVD进展加快。

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   • 图1C中的组织学结果（Alizarin Red染色）显示，高S1P组瓣膜显著增厚。

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   • 图1D和1E表明，高S1P组射血分数显著降低，瓣膜面积缩小，提示心脏功能受损。

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   • 心脏结构、超声心动图测定的左心室内径以及左心室质量在此时间点没有差异（图1F和1G），但高 S1P 组小鼠术后死亡率是升高的。

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2. 低S1P组（SphK1缺失） ：

   • 图1J和1K显示，SphK1基因敲除的小鼠瓣膜峰值速度和压力梯度显著降低，AVD进展明显减缓。
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   • 图1L显示，即使在低S1P背景下，DOP处理仍可逆转保护作用，加重AVD，进一步证实高S1P浓度对疾病进展的推动作用。图1M中的射血分数提升，心脏功能改善。​

   • 同时，图1S显示钙化程度减轻

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3. RANKL/OPG 比率：

   • RANKL 血浆水平在 SphK1-/- 中相较于对照组增加，并被 DOP 抑制（图 1T），而 OPG 在 DOP 处理的 SphK1-/- 中增加（图 1U）。与对照组相比，SphK1-/- 动物的 RANKL/OPG 比率减少，并在 DOP 处理后再次增加（图 1V）。RANKL/OPG 比率与 AS 严重性测量的峰值速度之间存在明显的负相关（图 1W）。​

2. S1PR2在AVD中的作用

由于S1P/S1PR2信号传导已被证明能够激活成骨细胞，并且S1PR2在血管外泌体中表达，我们检查了S1PR2-/-小鼠中AVD的发展。这些小鼠的S1P水平与野生型小鼠相似。

实验设计：

• S1PR2基因敲除组：探讨S1P通过S1PR2信号通路在AVD中的作用。
• 药物抑制组：使用S1PR2拮抗剂JTE-013评估其治疗潜力。

图表内容与解析：

1. S1PR2缺失组：

   • 图2A和2B显示，与野生型相比，S1PR2缺失小鼠的瓣膜峰值速度和压力梯度显著降低，提示S1PR2在AVD进展中的关键作用。

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   • 图2C显示S1PR2缺失小鼠瓣膜面积更大，且钙化程度较低，进一步支持S1PR2的病理作用。

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   • S1PR2缺失小鼠心功能也是有所改善的

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2. 药物抑制（JTE-013） ：

   • 图2K和2L表明，JTE-013在AVD诱导6小时后开始治疗，可显著减缓AVD进展，降低瓣膜峰值速度和压力梯度。

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   • 即使停止治疗，心脏功能的改善仍维持至12周，显示其潜在的长效保护作用。

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3. S1P诱导VIC钙化的机制

实验设计：

• 在人类瓣膜间质细胞（VICs）中模拟钙化条件，观察S1P对RUNX2和OPG表达的影响。

图表内容与解析：

1. S1P诱导钙化：

   • 图3A显示，S1P显著增强了VIC钙化（Alizarin Red染色），但S1PR2抑制剂JTE-013可以完全阻断这种作用。

     抑制S1PR2（JTE-013）而非S1PR1（W146）或S1PR3（TY-52156）防止了S1P诱导的VICs钙化

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2. 分子机制：

   • S1P通过S1PR2上调RUNX2、Osterix、OPG、Vinculin基因表达，从而推动钙化信号通路。

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   • 图3H显示，S1P刺激GSK3β磷酸化，从而激活Wnt-β-catenin信号，这进一步促进了钙化。

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4. 人瓣膜组织的S1P和剪切应力（shear stress）的关系

实验设计：

• 分析来自AVD患者的钙化瓣膜组织，测定S1P浓度和相关基因表达。
• 使用CMR影像技术评估力学应力对瓣膜的影响。

图表内容与解析：

1. 钙化瓣膜的S1P水平：

   • 图4A显示，AVD患者钙化瓣膜中的S1P水平是健康瓣膜的2.7倍。而血液中的浓度是接近的，说明 S1P 能在瓣膜组织内富集。

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   • 图4B显示SphK1（S1P生成酶）表达增加，而S1PR2表达无显著变化（图4C）。

2. 力学应力作用：

   • 图4E和4F显示，CMR图像中，AVD患者瓣膜的剪切应力显著增加。

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   • 单纯体外机械拉伸（10%，1 Hz）诱导VIC中S1P生成增加，并由SphK1酶介导（使用 PF-543 抑制k1 酶后，C17-S1P 减少）。

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原文讨论

本文主要发现和贡献

• S1P/S1PR2信号在AVD中的关键作用：

  • 增加S1P水平会促进瓣膜钙化，加重AVD进展，损害心脏功能；
  • 降低S1P水平或基因敲除S1PR2则显著缓解AVD进展。

• 机制简述

  • 机械应力诱导的SphK1生成增加而在瓣膜组织局部升高 S1P 水平；
  • VICs在S1P刺激下，激活成骨分化相关基因（如RUNX2和OPG），通过Wnt通路促进钙化。

• 新颖性：

  • 首次揭示S1P通过S1PR2介导瓣膜间质细胞（VICs）的成骨分化，并通过RUNX2/OPG和GSK3β-Wnt-β-catenin信号通路促进钙化。

• 药物干预潜力：

  • 当前AVD缺乏有效的药物治疗，研究结果表明S1PR2和SphK1可能是潜在的治疗靶点。

  • S1PR2拮抗剂（JTE-013）可有效阻止AVD进展，表现为减缓瓣膜钙化和改善心脏功能。

局限性

• 小鼠AVD模型的力学应力环境和瓣膜解剖结构与人类不同，可能限制研究的外推性。

• 目前研究主要基于动物模型和离体人类组织，缺乏大规模临床试验数据支持。

• S1PR2抑制剂的长期作用，特别是对骨骼健康的潜在影响，尚未深入评估。

未来研究方向

机制的进一步探索

• 验证力学应力如何与其他病理信号（如炎症因子）交互作用，驱动AVD进展。
• 深入研究S1P与其他成骨信号（如BMP-2、Notch）的协同作用。

药物开发

• 针对S1PR2的选择性抑制剂是否适用于长期治疗。
• 探索SphK1抑制剂的作用，并与S1PR2拮抗剂进行比较。

临床研究

• 开展针对AVD早期患者的S1PR2抑制剂临床试验，验证疗效和安全性。
• 结合影像学技术（如CMR）动态监测瓣膜钙化和剪切应力的变化。

我的讨论

逻辑回顾

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1. 从动物模型切入研究主题，探索S1P对 AVD 进展的影响，以及药物干预的有效性
2. 锁定受体S1PR2 为效应受体
3. 探索下游机制
4. 回到开头思考 S1P 在瓣膜组织内升高的原因：局部剪切力。最终形成逻辑闭环。

学到了什么

1. 动物模型的重要性：可以作为研究起点进行切入的，不一定要从人类样本的组织学检测开始

2. 创新性足够好时，没有生信分析支持也可以发高分

3. 开拓视野：机械应力与生物信号的相关性

4. 实验方法：

   • C17 Sphingosine Assay：同位素标记+质谱分析
   • 小鼠主动脉瓣口面积的计算公式：​
   • CMR（Cardiovascular Magnetic Resonance）评估主动脉瓣的剪切应力和血流动力学特性
   • VIC 的拉伸实验：培养板被放置在一个循环拉伸系统（Flex Jr Tension System）上。施加的循环机械拉伸呈心形波纹，产生的压力模式模拟了心跳产生的实际压力波，最大振幅为10%，持续24小时。拉伸频率为1 Hz。

局限性探讨

• 作为读者比较好奇本研究切入S1P的原因是什么？但文中未给出的说明。

• 力学应力与生物信号之间的因果链条未完全闭合：文章多次提到机械应力增加SphK1的活性并导致局部S1P水平升高，但对于力学应力如何启动SphK1的激活缺乏深入阐释。例如，是否需要特定的信号分子参与？

• 钙化机制的时间线描述略显模糊：如S1P刺激VICs后不同时间点RUNX2/OPG的变化

• 小鼠模型给药方式的疑问：如何确定给药剂量和给药时间？

  • DOP：饮用水给药，180mg/L，造模前 1 周开始直到实验结束（预防？）
  • JTE-013：腹腔注射，按体重30mg/kg，造模后 6h 首次给药，每日 1 次，仅持续 2 周（早期干预？）

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本文探讨了鞘氨醇-1-磷酸（S1P）信号通路在主动脉瓣疾病（AVD）进展中的作用。研究显示，随着人口老龄化，AVD 在老年人群中日益普遍，现有的治疗手段主要限于瓣膜置换，缺乏有效的药物干预。本研究通过小鼠模型验证了高S1P水平加速AVD进展的机制，并发现降低S1P水平可显著减缓病程。此外，S1PR2的脱落也表明其在AVD发展中的关键角色。研究结果表明，靶向S1P信号通路可能成为延缓AVD进展的新策略，为未来药物开发提供了理论基础。这项研究为主动脉瓣疾病的治疗提供了新的视角，强调了S1P在钙化过程中的潜在影响，以及针对S1P信号通路的干预可能带来的临床益处。