Circulation：主动脉瓣钙化是由ALDH1A1的丧失引起的，并且可以通过视黄酸受体α的激动剂来预防

Title：Aortic Valve Calcification Is Induced by the Loss of ALDH1A1 and Can Be Prevented by Agonists of Retinoic Acid Receptor Alpha: Preclinical Evidence for Drug Repositioning

引文

研究背景（Background）：

• 主动脉瓣狭窄（Aortic stenosis, AS）是 65 岁以上成年人中最常见的心脏瓣膜疾病之一，发生率为 2%-5%。目前，对于重度主动脉瓣狭窄，唯一有效的治疗方法是瓣膜置换手术。
• 随着经导管主动脉瓣置换术（Transcatheter Aortic Valve Replacement, TAVR）适应症扩展至年轻患者，生物瓣膜（Bioprosthetic Valves, BPVs）的使用大幅增加。
• BPVs 的主要问题在于耐久性有限，原因是结构瓣膜退化（Structural Valve Deterioration, SVD），而 SVD 主要表现为瓣膜纤维钙化，与天然主动脉瓣狭窄类似。
• 在未来几年，因 SVD 需要再次手术的患者数量将明显增加，这成为一个重要的临床问题。因此，识别预防或减缓瓣膜纤维钙化的治疗靶点被认为是领域内亟待解决的重要科学问题之一。

研究目的（Objectives）：

• 使用无偏转化研究方法，寻找防止主动脉瓣与生物瓣膜钙化的新治疗靶点。

研究现状和存在的问题（Current Status & Gaps）：

• 当前有多个临床试验正尝试针对已知途径（如 Lp[a]、LDL 胆固醇、炎症、血管紧张素受体阻滞剂）和新的途径（如 DPP4）进行治疗。然而，目前尚无任何药物证实在主动脉瓣狭窄或 SVD 的治疗中具有明确的疗效。
• 因此，利用已批准上市药物进行重新定位（药物重定位策略​）以预防主动脉瓣钙化的研究具有显著的临床潜力。“老药新用​”

研究假设（Hypothesis）：

• 本研究基于无偏的转录组学分析，发现 ALDH1A1 基因在钙化瓣膜中的表达显著下调，推测 ALDH1A1 的缺失促进瓣膜间质细胞（VIC）向成骨样表型转变，从而加速瓣膜钙化。
• 因此，假设通过激活视黄酸受体 α（Retinoic Acid Receptor Alpha, RARα）途径（使用 ALDH1A1 代谢产物全反式维甲酸 ATRA）可阻断或逆转 VIC 成骨样转化，预防钙化进展。

研究设计概要（Methods Summary）：

• 从接受主动脉瓣置换术患者和器官供体心脏中收集主动脉瓣组织，进行转录组学分析。
• 分析 ALDH1A1 下调的机制，并评估抑制 ALDH1A1 对人类主动脉瓣 VIC 成骨标志物表达与钙化的影响。
• 评估全反式维甲酸（ATRA）在体外人类 VIC 培养系统以及动物模型（大鼠皮下植入牛心包膜模型、羊异种主动脉瓣置换模型）中的抗钙化效果。

研究的创新点（Innovation）：

• 首次发现 ALDH1A1 作为主动脉瓣钙化的重要调节因子。
• 创新地提出利用已批准药物（视黄酸类药物）作为预防主动脉瓣钙化药物的重新定位策略。

研究意义（Clinical Implications）：

• 研究结果可能提供全新的治疗策略，以延长生物瓣膜寿命和延缓严重主动脉瓣狭窄疾病进展。
• 未来可探索开发视黄酸类药物涂层的生物瓣膜，从根本上提高瓣膜的耐久性和使用寿命。

本文的主要研究结果

一、ALDH1A1 在钙化主动脉瓣膜中的表达显著降低，且与主动脉瓣狭窄严重程度相关

• 实验设计与方法概述：

  • 收集了严重主动脉瓣狭窄（AS）患者的钙化瓣膜组织（n=58，三叶瓣 n=36、二叶瓣 n=22）和非严重 AS 的对照瓣膜组织（n=29）。
  • 提取主动脉瓣膜间质细胞（VIC），并进行转录组分析（Affymetrix 芯片技术），同时通过 qPCR、蛋白质印迹法进一步验证 ALDH1A1 表达水平。

• 结果：

  

  • 转录组分析显示，ALDH1A1 为钙化瓣膜最显著下调的基因之一（下调 7.3 倍，P=0.0024，Figure 1B）。
  • qPCR 和 WB 进一步证实钙化瓣膜 VIC 中 ALDH1A1 的 mRNA 和蛋白表达均明显降低（mRNA 下调 9.8 倍，P=0.0002；蛋白下调 2 倍，P=0.0036；Figure 1E-G）。

  

  • ALDH1A1 表达与瓣膜病变的严重程度指标呈相关性：与瓣膜最大速度、跨瓣平均压力梯度负相关，而与主动脉瓣面积呈正相关（Figure S4）。

二、TGF-β1 通过 SMAD2/3 信号通路下调人主动脉瓣膜 VIC 中的 ALDH1A1 表达

• 实验设计与方法概述：

  • 使用来自对照瓣膜组织的正常人 VIC 进行培养，加入 TGF-β1 刺激 48 小时，同时设置 SMAD2/3 抑制剂（SB431542）干预组。
  • 通过 qPCR、Western blot、免疫荧光检测 ALDH1A1 表达和 SMAD2/3 信号通路的活化情况。

• 结果：

  

  • 序列分析推测 ALDH1A1 启动子序列含有 SMAD4 结合位点，考虑 ALDH1A1 的转录受到 TGFβ/SMAD2/3 通路调控

  

  • TGF-β1 刺激后 ALDH1A1 表达明显降低（mRNA 水平下降 95%，P=0.028；蛋白表达显著降低，P=0.0055；Figure 2B-D）。
  • SB431542 抑制剂能够显著逆转 TGF-β1 导致的 ALDH1A1 表达下调（Figure 2B-D）。
  • 免疫荧光显示，TGF-β1 诱导 SMAD2/3 转移至细胞核内，而抑制剂则阻止了这种转移现象（Figure 2E-F）。

三、ALDH1A1 抑制导致主动脉瓣膜 VIC 向成骨表型转化并促进钙化发生

• 实验设计与方法概述：

  • 使用正常 VIC 进行培养实验，通过 siRNA 沉默 ALDH1A1 基因表达或 ALDH1A1 抑制剂（DEAB）处理 7 天，同时给予成骨诱导培养基（OM）。
  • 使用 qPCR 检测成骨标志基因表达（ALP、RUNX2、MSX2），钙化程度通过荧光染料（OsteoSense 680EX）评估。

• 结果：

  

  • ALDH1A1 基因沉默或抑制后，成骨相关基因 ALP、RUNX2 和 MSX2 表达显著增加（Figure 3B-D, 3H-J）。
  • 荧光显微镜观察到钙化明显增加（比对照增加 2 倍，P=0.0010；Figure 3F-G）。

四、ATRA 通过 RARα 受体途径逆转 VIC 的钙化和成骨表型转化

• 实验设计与方法概述：

  • 全反式维甲酸 ATRA​ 是 ALDH1A1​ 代谢产物，能够激活视黄酸受体 α（Retinoic Acid Receptor Alpha, RARα​）通路
  • 正常 VIC 在成骨诱导培养基（OM）中培养，同时加入不同浓度的 ATRA 处理 7 天。
  • 另使用 RAR 特异性激动剂（RARα 激动剂 Am80，RARβ 激动剂 CD2314，RARγ 激动剂 CD437）分别处理 7 天。
  • 通过荧光钙化检测法和 qPCR 检测相关基因表达。

• 结果：

  

  • ATRA 剂量依赖性地减少钙化沉积（最高剂量 1000nM 时减少 2 倍，P=0.012；Figure 4B-C）。
  • ATRA 明显增加 ALDH1A1 表达并抑制成骨基因 ALP、RUNX2、MSX2 的表达（Figure 4D-G）。
  • RARα 特异激动剂 Am80 也显著抑制钙化沉积（P=0.017），且下调了成骨基因表达，而 RARβ 或 RARγ 激动剂无明显效果（Figure 4H-M）。

五、转录组分析显示 RARα 激动剂（Am80）逆转了 VIC 中的成骨基因表达谱

• 实验设计与方法概述：

  • 在体外 OM 培养的 VIC 细胞中，用 RARα 特异激动剂 Am80 处理 24 小时后进行转录组芯片分析（Affymetrix 芯片）。

• 结果：

  

  • 转录组分析发现 Am80 显著逆转了 OM 诱导的骨化基因表达模式，包括 RUNX2 下游基因以及调控钙化的重要抑制因子（如 MGP、SOX9、SMAD3、PPARG、TNFAIP6、TMEM64、NOCT）的表达增加（Figure 5A-F）。

六、ATRA 在动物模型中有效抑制主动脉瓣膜与生物瓣膜的钙化

• 实验设计与方法概述：

  • 羊模型
    • 将猪主动脉瓣移植至羊肺动脉位置，模拟瓣膜钙化。分为 ATRA 口服治疗组（20mg，每日两次，共 4 个月）和对照组。
    • 超声心动图每月评估瓣膜功能，4 个月后组织学和蛋白分析。
  • 大鼠模型
    • 牛心包组织表面涂层 ATRA 后植入大鼠皮下，观察 30 天。
    • 组织取出后茜素红染色评估钙化情况。

• 结果：

  

  • 羊
    • ATRA 治疗组瓣膜最大血流速度、跨瓣压力梯度明显降低（Figure 6B, S7A-C）。
    • 组织学染色钙化面积明显减少（Figure 6C-D），RUNX2 蛋白表达显著降低（Figure 6E-F）。
  • 大鼠
    • ATRA 涂层组牛心包组织钙化显著减少（钙化面积由对照组 35% 降至约 12.5%，P<0.0001；Figure 6H-I）。

原文讨论

ALDH1A1 在主动脉瓣钙化中的关键角色及临床意义

• 主要观点： ALDH1A1 表达显著下调是主动脉瓣钙化的重要分子特征，且与主动脉瓣狭窄（AS）严重程度密切相关。
• 支撑证据与逻辑：
  • 该研究首次通过人类主动脉瓣 VIC 转录组分析发现，ALDH1A1 在钙化瓣膜组织中表达显著降低。
  • 以往文献（如 Bossé 等的研究）也支持该研究结论，显示了 ALDH1A1 的普遍下调，进一步验证了 ALDH1A1 在瓣膜钙化中的作用。
• 临床意义：
  • 尽管 ALDH1A1 在血浆中并未表现出生物标记物潜力，但其在瓣膜组织中的局部作用对揭示瓣膜钙化的病理机制具有重要意义。

TGF-β1/SMAD 通路介导 ALDH1A1 表达的调控机制

• 主要观点： ALDH1A1 的表达受 TGF-β1 诱导下调，并由 SMAD2/3 通路介导。
• 支撑证据与逻辑：
  • 本研究首次明确了 TGF-β1 诱导的 SMAD2/3 磷酸化可导致 ALDH1A1 表达显著下调。
  • 这一发现与已有的肿瘤领域研究结果（如胰腺癌研究）一致，即 TGF-β/SMAD 通路对 ALDH1A1 表达存在调控作用。
• 潜在意义：
  • 这一机制的发现为主动脉瓣钙化的治疗提供了明确的分子靶点，即抑制 TGF-β1/SMAD 信号可能成为预防或延缓瓣膜钙化的策略之一。

ALDH1A1 下调诱导 VIC 成骨转化的机制解析

• 主要观点： ALDH1A1 表达下降直接导致了主动脉瓣膜细胞（VIC）向成骨表型转化，加速了钙化过程。
• 支撑证据与逻辑：
  • 通过 siRNA 或抑制剂（DEAB）阻断 ALDH1A1 后，VIC 细胞中关键成骨基因（RUNX2、ALP、MSX2）表达显著增加，钙化程度加剧。
  • 文献中也支持类似的生物机制，如 ALDH1A1 敲除小鼠表现出成骨活性增强的表型。
• 机制阐释：
  • ALDH1A1 活性下降导致其代谢产物（ATRA）生成减少，促使 VIC 细胞启动成骨程序，从而诱发主动脉瓣膜钙化。

维甲酸受体 α（RARα）通路作为预防主动脉瓣钙化的治疗靶点

• 主要观点： RARα 激动剂（如 ATRA 和 Am80）具有强大的抗钙化效应，通过抑制 VIC 的成骨表型发挥作用。
• 支撑证据与逻辑：
  • 本研究明确显示 ATRA 或 RARα 特异性激动剂 Am80 处理后，钙化相关基因表达被显著抑制，并有效阻止了钙沉积。
  • 进一步的转录组分析揭示 Am80 能够显著逆转成骨相关的基因表达模式（如抑制 RUNX2、上调抗钙化基因 MGP、SOX9 等）。
• 治疗前景：
  • 维甲酸及其受体激动剂属于临床已获批准的药物，药物再定位（drug repositioning）策略有望快速进入临床研究阶段，具有极佳的临床转化潜力。

动物实验的临床前证据与潜在临床应用

• 主要观点： 在两种动物模型（大鼠和羔羊）中，ATRA 均显示出显著的抗钙化作用，进一步强化了其临床前药效学证据。
• 支撑证据与逻辑：
  • 羔羊瓣膜移植钙化模型中口服 ATRA 显著改善了瓣膜功能，钙化减少明显，RUNX2 表达降低。
  • 大鼠皮下牛心包模型的结果也证实了 ATRA 涂层的生物瓣膜钙化抑制作用。
• 临床转化思考：
  • 研究提出将 ATRA 或 RARα 激动剂用于早期 AS 患者或二叶瓣患者治疗，具有推迟首次手术时机、减少再次手术风险的潜在巨大临床收益。
  • 通过生物瓣膜表面涂层 ATRA，类似冠脉支架的药物涂层策略，可能延长生物瓣膜的使用寿命并拓宽其适用人群。

研究的局限性与未来方向

• 局限性：
  • 研究的瓣膜样本主要为严重 AS 晚期患者，可能未能全面代表 AS 疾病进程早期的生物学特征。
  • 尽管提供了高质量的人类对照组织，但对照组中部分存在中度 AS 患者，可能影响结果的精确性。
  • 仅使用了雄性动物模型，未考虑性别差异可能对钙化的影响。
  • 体内实验仅测试了 ATRA，尚未评估 Am80（RARα 特异激动剂）等其他药物的疗效与安全性。
• 未来研究方向：
  • 建议在更早期的 AS 患者群体中进一步验证 ALDH1A1 表达变化。
  • 建议开展性别差异对主动脉瓣膜钙化影响的深入研究。
  • 鼓励后续动物研究测试更具临床安全性和药代动力学优势的 RARα 特异激动剂 Am80。

我的讨论

创新性

1. 本研究提出的科学问题非常贴近临床：随着 TAVR 适应症扩展至年轻患者，生物瓣衰败是目前临床上的 TAVR 的关键局限性之一；
2. 研究结果转化价值高：整体研究不仅探讨了原生主动脉瓣狭窄，还扩展到了 TAVR 术后生物瓣衰败的问题，两者均以瓣膜的纤维钙化为主要特征；
3. 相对完善的临床前研究：体外（细胞表型、机制），体内（大鼠、羊），体内模型比较新颖
4. 临床应用的可能性高：老药新用，扩展了原本药物的适应症，并且相对来说具有较好的安全性，有助于降低研发成本，提高了药物临床应用的可能性。

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本研究探讨了主动脉瓣钙化的机制以及潜在的预防策略。研究发现，ALDH1A1基因在钙化的主动脉瓣膜中显著下调，其缺失可能促使瓣膜间质细胞向成骨样表型转变，从而加速钙化进程。此外，TGF-β1通过激活SMAD2/3信号通路下调ALDH1A1表达，进一步促进钙化。为评估药物干预，本研究使用全反式维甲酸（ATRA）作为视黄酸受体α（RARα）的激动剂，在体外和动物模型中测试其抗钙化效果。结果表明，ATRA能够有效阻断VIC的成骨转化，并降低钙化程度。此研究首次确认ALDH1A1在主动脉瓣钙化中的关键作用，并提出重新定位已批准药物以防治主动脉瓣钙化的可能性，为延长生物瓣膜使用寿命提供了新思路。