A disease-driver population within interstitial cells of human calcific aortic valves identified via single-cell and proteomic profiling （Cell Reports IF=9.4）-香草杏仁

“single-cell RNA seq”，“干细胞与转分化”。参与CAVD疾病驱动VICs亚群DDP-VICs（CD44^high^CD29^+^CD59^+^CD73^+^CD45^low^）

总结

作者通过高通量流式检测鉴定出一个参与CAVD疾病驱动VICs亚群DDP-VICs（CD44^high^CD29^+^CD59^+^CD73^+^CD45^low^）
该亚群具有多向分化潜能（包括成骨、成软骨、成脂肪）
单细胞转录组分析结合蛋白质组学分析发现MAOA和CTHRC1可能作为潜在的治疗靶点
体外实验证明了以上靶点的有效性

研究技术

HTS-FC
？a tissue-spread technique IHC，与普通IHC相比能够更好的保存组织的3维结构
激光扫描共聚焦的三维重建
免疫组化的空间分析（有点类似于空间转录组学分析的形式）
多色免疫荧光（五标六色）
CyTOF （一种蛋白质谱技术）
单细胞转录组测序
蛋白质组学分析

结果解读

MSCs和VICs的共有的细胞表面标记物

作者提出的假说认为主动脉瓣中存在一类祖细胞样VICs驱动钙化形成。

检测样本（4组）
- 8个CAVD手术标本
- 未分化MSCs（NM）
- 成脂诱导的MSCs（AM）
- 成骨诱导的MSCs（OM）
检测方法
- 是BD公司的一套细胞表面标记物流式单细胞检测方案，包含了242个细胞表面分子
- 本质上是运用了抗原抗体的结合，特异性高。与单细胞转录组测序（scRNA-seq）在原理上完全不同。

外圈的环形热图
- 242个细胞表面分子阳性细胞在4组样本中的比例分布
- 以CD44为例，热图上显示该分子在4行中的都很红，表明四组样本中CD44+的细胞比例均很高，进一步推测CD44是VICs中具有类似MSCs功能的祖细胞标记物之一。
圈内的PPI网络图
- 13个细胞表面分子（红点）
- 以上分子的近邻（黄点）
- 钙化相关分子（蓝点）：osteocalcin, tissue-nonspecific alkaline phosphatase [ALPL], RUNX2, and osteonectin
- CD44的圈很大（与其互作的分子较多），说明其在网络中可能起到关键作用（hub node）

以下分子（16个）在四组细胞中均>85%细胞比例：CD13, CD29, CD44, CD47, CD49e, CD55, CD58, CD59, CD63, CD73, CD147, CD151, CD164, beta2-microtubulin, HLA A-B-C, and HLA-B2。而CD38和CD45则具有较大差异（这两个分子是典型的白细胞表面标记物）

CD44^+^VICs分布在主动脉瓣钙化区周围

对祖细胞、成骨、成纤维细胞标记物进行检测
CD44 在F层的比例最高，而已知F层VICs具有更强的钙化潜能。进一步推测CD44^+^VICs的潜在功能。

CD44^high^VICs在功能和空间分布上均与钙化显著相关

IHC检测发现CD44^high^VICs大量分布在钙化区域周围

免疫荧光染色检测到CD44与OCN的共表达（激光共聚焦拍摄，z轴扫描，三维重建）
CD44与OCN共表达细胞的核形态不规则，这些细胞核多为串珠状或铃铛状（bell shaped），与胚胎发育过程中的代核祖细胞（metakaryotic）非常相似。(Gostjeva et al., 2009).
进一步推测其也具有祖细胞特性。

CD44^+^CD29^+^细胞多分布在钙化区域附近（CD29是祖细胞标记物之一）
CD44^+^CD29^-^细胞离钙化区域较远
正常主动脉瓣中CD44^+^与CD29^+^细胞均较少

参数：
祖细胞样VICs（CD44^+^CD29^+^细胞）的细胞核倾向于更大，而且异质性更高，可能与染色质活动的变化相关。

流式分选组织中的CD44^high^与CD44^+^细胞，分别用于促钙化/成骨分化培养。CD44^high^细胞的钙化潜能更高，CD44^+^次之，混合细胞钙化潜能弱。
PM：高磷酸盐促钙化培养基
OM：成骨分化诱导培养基
补充验证
- MIX VICs在PM中能够产生钙化，为了证明是由于混合的VICs中CD44+细胞引起的，使用siRNA敲低CD44后，钙化潜能降低。

成骨样CD44^high^VICs同时表达CD29, CD59, CD73祖细胞标记物

作者定义了主动脉瓣中的成骨样祖细胞为 CD44^high^CD29^+^CD59^+^CD73^+^CD45^low^VICs

作者根据图1中HTS-FC找到的13个细胞表面分子，进一步通过文献检索，识别到CD44, CD73, CD29, CD13, CD55, CD49e, CD147, and CD59等分子是引用较多的MSCs标记物。
而与钙化相关的CD分子有：CD29, CD44, CD13, CD63, CD73, CD59, CD55, and CD49e
两者的交集：CD44, CD29, CD13, CD73, CD55, CD59, and CD49e

检测以上分子的共表达：发现在CD44^high^VICs中存在CD29、CD59、CD73的表达，而几乎没有CD13、CD55的表达

分别分析IHC中CD44、CD29、CD59和OCN阳性细胞的空间分布情况，发现均在钙化周围分布较高，而远离钙化的区域降低
至此，将成骨样祖细胞定义为CD44^high^CD29^+^CD59^+^CD73^+^CD45^low^VICs

CD73

体外培养的VICs：MIX vs Progenitors
多色免疫荧光（五标六色）

CD44^high^CD29^+^CD59^+^CD73^+^CD45^low^VICs在体外培养中具有多向分化潜能

将CAVD标本分选得到的CD44^high^CD29^+^CD59^+^CD73^+^CD45^low^VICs命名为DDP-VICs（Disease Driver Population），未分选的混合VICs称为MIX-VICs

DDP具有与MSCs相似的多向分化潜能
- Alizarin Red：成骨/钙化
- Oil Red O：脂肪
- Alcian Blue：软骨

qPCR相对定量
- DDP在OM中培养后成骨相关的基因明显高于其他组
- 钙化能力显著高于MIX

CyTOF进一步验证DDP的祖细胞表型

SPADE可视化生成的细胞聚类图谱（一个点表示一个cluster）
框出来的区域展示了CD44高表达的细胞

成骨、增殖、祖细胞等标记物均在DDP区域表达高，且阳性细胞比例多

单细胞转录组测序鉴定DDP成骨分化过程中的高表达基因

tSNE降维
- MSCs在OM培养后表现出更高的异质性（分出了5个亚群），而在NM中维持一个亚群k2.（B、C）。但是OM组与NM组没有细胞重合。
- VICs的情况与MSCs相似，但混合程度更高一些。VIC-NM和VIC-OM均是DDP组与MIX组的混合
基因表达热图
- 展示了各亚群基因表达的变化，SPARC（成骨标记物）在OM组中高表达，尤其是k4亚群。其余升高的基因包括osteoprotegerin (osteoclastogenesis inhibitory factor/ TNFRSF11B), osteonectin (SPARC), SPOCK1, elastin, Thy-1 (CD90), and several collagen-related proteins (CTHRC1, COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL4A1, COL5A1, and COL5A2)等
- VICs中k4亚群也是具有最高的成骨活动，与MSCs的k4相似，而这个k4亚群主要由DDP-OM构成。高表达基因包括 MAOA, PHACTR2, TGFRB2, HIF-1A, elastin, and collagen regulation-associated proteins (COL8A1, lysyl oxidase, CTHRC1).