细胞化学技术-香草杏仁

在保持细胞结构完整的条件下，借助细胞中的化学反应在细胞原位确定化学成分的分布、量及其在细胞活动中的动态变化的技术，达到定性、定位和相对定量的目的，用以阐明化学成分在细胞中的功能、与疾病的关系，或指示细胞的状态等。

特点：

原位：组织细胞固定（Fixation)，保留分子在原位
化学反应：
- 酶细胞化学技术：酶+底物显色反应
- 免疫细胞化学技术：抗原+抗体显色反应
- 放射自显影技术：放射性同位素衰变和涉嫌的释放反应+感光
- 原位杂交技术：核酸杂交反应+显色反应
配合显微镜观察

免疫细胞化学（ICC）与免疫组织化学（IHC）

利用免疫化学反应在细胞原位定位和（相对）定量组织细胞和培养细胞中特异分子的技术

原理

抗原

刺激机体产生抗体并能与抗体特异结合的物质

细胞中具有抗原性的化学成分：蛋白质，多肽，脂蛋白，多糖，脂多糖，糖蛋白，核蛋白、酶、受体、细胞外基质、激素、细胞结构蛋白、病原体等都可以用免疫细胞化学技术来检测

抗体（一抗、二抗）

具有抗原特异性和种属特异性

二抗：抗种属抗体，识别一抗的种属特异性，并能够因此结合一抗

多克隆抗体是针对抗原的多个位点的，故灵敏度高，但是可能会有较多的非特异性结合。

单克隆抗体针对某一特定抗原表位，故特异性高

选择抗体时需要兼顾灵敏度和特异性

免疫反应

反应缓冲液(reaction buffer)： TBS
抗体滴度是最关键的因素，参照说明书与实际实验优化
减少非特异反应：脱脂牛奶或牛血清白蛋白封闭
孵育温度： 37℃；室温； 4 ℃
孵育时间：随温度不同而不同
湿度

标记物的显示或显色反应

荧光素、酶、胶体金颗粒

免疫荧光技术

荧光素

关于荧光素的知识，在荧光显微镜中已经涉及

特点和应用

多重染色→标记物质的颜色+叠加颜色的出现

信号强，与背景对比清晰
目标分子1+目标分子2：多分子共定位
目标分子+细胞器荧光标记：亚细胞定位
根据荧光素的强度进行定量分析

免疫酶技术

常用的酶

辣根过氧化物酶（HRP）：

底物 DAB，产物为DAB氧化聚合物（棕黄色）

既适用于光镜，又适用于电镜

碱性磷酸酶（AKP）：

底物1：吲哚酚酯，产物：蓝紫色 (常用）

底物2：底物：萘酚衍生物蓝或红偶氮色素

信号的放大

亲和物质的使用能够提高免疫酶标记的灵敏度

生物素和亲和素：结合能力强，结合不可逆
葡萄球菌A蛋白-免疫球蛋白IgG

常用亲和素－生物素-酶复合物技术（Avidin-Biotin peroxidase Complex ， ABC）

免疫胶体金技术

亚细胞定位：超微结构定位（要用电镜观察）
双重标记：位置的相互关系不同大小的金颗粒(5-20nm) 标记不同抗体，双重甚至多重标记，指示分子的相互作用

原位杂交技术 In Situ Hybridization，ISH

将分子生物学技术与细胞化学技术相结合，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位与细胞内需探测的核酸杂交, 检测特异核酸分子的技术。结果既可以反映特异核酸分子的量，又可以反映核酸与组织、细胞、细胞器或染色体的位置关系。

原理：核酸杂交反应+标记物的显色反应

靶核酸

RNA：mRNA、非编码RNA：mi-RNA、 LncRNA、病毒RNA等

DNA：染色体DNA、线粒体DNA、病毒DNA

标记探针

探针：带有标记的，能与组织细胞内靶核苷酸序列互补结合的一段核酸分子。主要包括cDNA探针， RNA探针，寡核苷酸探针。

寡核苷酸探针最常用：10~50bp，易获得，搜索序列公司合成、易杂交、特异性低

标记物：32P＞ 35S＞ 3H ＞荧光素＞地高辛/生物素

放射性标记物：同位素 32P＞ 35S＞ 3H

非放射性标记物：荧光素

非荧光性标记物：地高辛Digoxin、BrdU、生物素Biotin

原位杂交反应

影响原位杂交结果的重要因素

缓冲液
- 钠盐（Saline-Sodium Citrate, SSC液）： ↑ 杂交效率（5×, 4×, 2×, 1× , 0.5×SSC液）
- 甲酰胺： ↓ 杂交所需温度（50%）
- 硫酸葡聚糖： ↑探针有效浓度
- 牛血清白蛋白和载体DNA等： ↓背景阻断探针与组织非特异结合
探针浓度放射性标记探针： 0.5μg/ml 非放射性： 2.0μg/ml

最适宜的探针浓度要经实验摸索得到确定
温度一般低于相应杂交体Tm值25℃
pH：通常6.5-7.5
时间：4-6小时，通常overnight

杂交反应条件的严格度（stringency）：决定探针是否与含不相配碱基的核酸序列结合的条件，是决定杂交双链间形成氢键稳定性的条件，也是最终影响特异性的反应条件。

高严格度条件：碱基完全互补的双链才能形成杂交体（高温度、高甲酰胺浓度、低离子强度）

低严格度条件：碱基不完全互补的双链也能形成杂交体

杂交反应条件的严格度原则：杂交时低严格度，漂洗条件高严格度。灵敏度差则降低漂洗的严格度。特异性差则提高漂洗的严格度。