激光扫描共聚焦显微镜和超高分辨率显微镜

分子标记物：荧光素 Fluophore

能够吸收能量并在释放能量的过程中发光，吸收短波长的能量后发射出长波长的光。当激发照射停止，发射光也消失 。荧光素都需要知道2个波长：

• 激发光波长（excitation wave length， Ex)
• 发射光波长 (emission wave length， Em)

常用荧光素：数字表示激发光波长

荧光素的特点

1. 荧光素都需要特异波长的光照射激发，再观察到发射光

2. 光漂白(Bleaching)：荧光素被多次照射后，发射光也会消失

3. 光淬灭(Quenching)：荧光素放置过久或接触某些化学物质，光消失

种类

1. 荧光染料 (Stains) ：与组织细胞的某些成分直接结合的染料，如核酸染料DAPI。

2. 荧光标记抗体（Fluorescent conjugated-antibody）：荧光标记抗体结合组织抗原-免疫荧光技术

3. 荧光蛋白 (Fluorescent Protein)：将基因导入细胞，作为目标蛋白的标签，指示目标蛋白，如GFP。

荧光显微镜

普通荧光显微镜成像存在缺陷

激光共聚焦显微镜 LSCM

​ 以激光作为激发光源，对荧光标记样本进行断层扫描，采用光源针孔与检测针孔进行聚焦，将高灵敏度探测器，高性能计算机/图像处理软件相结合的高精度显微成像系统，达到获得高分辨率、高对比度图像的目标。

原理

1. 激光光源：光色纯、方向性好（点光源）、亮度高
2. 扫描样品：断层、逐点、逐行扫描 “CT”
   
3. 共聚焦成像：双针孔（光源针孔、检测针孔）
   
4. PMT对图像的探测和数字信号转换

特点

优点：高分辨率、高对比度

局限：成像速度慢、观测厚度：50~100μm、分辨率极限0.15μm

功能

基本功能：薄层断层扫描

多通道同时扫描

避免普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，多种荧光标记样品需要多次观测，对样品和荧光损伤大。

ZOOM成像

不变换镜头的情况下，对某幅图片的局部放大，重新进行更细致的逐点扫描，获得更高分辨率图像。

多维度成像

在Z轴（垂直）上逐点扫描获得光学横断面图像，合成三维立体图像

定量分析

应用

静态检测

检测分子的定位、分子的量及分子间相互作用

动态检测

• 大分子的移位 (translocation)

• 动态的蛋白质相互作用 (FRET)

• 分子运动的测量 (FRAP, FLIP)

• 离子浓度的变化

超高分辨率显微镜（了解）

主要原理

1. 基于点扩展函数调制
2. 基于随机单分子定位：不让两个靠得很近的点同时亮起来