电镜技术

电子显微镜以电子射线作为照明光源，以电磁场作为透镜，具有高分辨率和放大倍率的显微镜。电镜用于研究组织和细胞的超微结构。

电子与样品作用后产生的电子信号主要有：透射电子和二次电子

透射电子（transmission electron）：当样品厚度小于100nm时，部分电子可穿透样品，将穿透样品的电子叫做透射电子，利用透射电子信息成像的称为透射电镜。
二次电子（Second electron）：在入射电子的轰击下，样品表面5～50nm深度激发出来的电子称为二次电子，利用二次电子信息成像的称为扫描电镜。
分辨率（resolution）：表示人眼和光学仪器能够辨别两点之间最小距离的标志。

电镜的种类：

• 透射电镜
• 扫描电镜
• 高压电镜
• 分析电镜
• 冷冻电镜

透射电子显微镜 Transmission Electron Microscopy

工作原理

• 电子束投射在样品上，部分电子直接穿透样品产生透射电子
• 带有样品信息的透射电子经成像系统放大，投射到荧光屏上
• 透射电子多，荧光屏亮；反之荧光屏暗，荧光屏的亮暗程度与样品微细结构一一对应，产生具有一定反差的黑白影像

TEM的样品制备技术

⭐超薄切片技术 Ultramicrotomy

取材→预固定→后固定→脱水→浸透→包埋聚合→修块→切片→染色

⭐取材

取材要点：快、小、轻、冷

• 快：1分钟内固定，尽可能保持其生活状态，因为瞬间的拖延都会导致细胞超微结构的变化
• 小：约1mm³的小块，组织块过大其中央得不到及时固定会发生细胞自溶现象
• 轻：不要牵拉、锯、挤压组织，避免细胞受到损伤
• 冷：低温操作，4℃保存，降低酶的活性，避免组织发生自溶

固定：

• 组织块浸泡固定

  

• 血管灌注固定

  

常用的固定剂：
预固定：1.5 %～5 %戊二醛（0.1M PB配置 ）
后固定： 1 %锇酸（四氧化锇）水溶液

脱水：

• 50% 乙醇 10～15分钟，4℃
• 70% 乙醇 10～15分钟，4℃
• 80% 乙醇 10～15分钟，4℃
• 90% 乙醇 10～15分钟，4℃
• 100%乙醇 10分钟，3次，室温

浸透与包埋聚合

将树脂浸透到组织内

切片：

半薄切片（500nm）→ 超薄切片（50~100nm）

为什么要进行半薄切片？

• 选取超薄切片的部位，超薄切片的面积一般小于0.5mm2，要经过半薄切片来选取有意义的部位
• 对同一部位进行光电镜对比观察，可以在较大范围内了解组织结构、病变部位和病理性质
• 用于图像分析，统计学处理

超薄切片：将环氧树脂包埋的组织块切成100nm以下的薄切片称为超薄切片，超薄切片经电子染色后在TEM下观察组织细胞内部的超微结构

负染色技术 Negative staining technique

通过重金属盐在样品四周堆积,加强样品外周的电子密度，衬托样品的形态和大小
方法：将样本离心悬浮，染色液1～3分钟，电镜观察
应用于：

• 细菌、病毒、噬菌体等微生物大分子结构
• 亚细胞碎片以及分离的细胞器等
• 纳米颗粒

免疫电镜技术 Immune Electron Microscopy

免疫电镜技术是将免疫学方法与电子显微镜技术相结合，利用抗原与抗体特异结合的特性，在超微结构水平定位特异大分子的技术

• 包埋前法：先免疫标记，后包埋、制备超薄切片。适用于抗原暴露在外的情况，如膜外周蛋白 。超薄切片可按常规电镜标本制备技术进行
• 包埋后法：先包埋，制备超薄切片，后免疫标记 。适用于细胞内抗原，超薄切片技术需按免疫电
  镜标本制备技术进行 。
• 冷冻超薄切片方法 ：冷冻超薄切片机将标本直接切成超薄切片，进行免疫反应，电镜观察 。

TEM在医学领域的应用

• 细胞器、组织器官的超微结构

  

• 原核细胞、病毒的超微结构

  

• 原核细胞、病毒的超微结构

  

• 超微病理变化

  

• 细胞成分的定位

• 生物材料复合体

扫描电子显微镜 Scanning Electron Microscopy

工作原理

• 电子光学系统
• 信号检测及显示系统
• 电源和真空系统

样品制备

• 取材 充分暴露并保护观察面（5×5mm）

• 清洗 用生理盐水仔细漂洗观察面

• 固定 2.5%戊二醛和1%锇酸固定

• 脱水 丙酮逐级脱水，醋酸异戊酯置换

• 干燥 临界点干燥

• 镀膜 离子溅射镀膜或真空镀膜

• SEM观察

SEM的应用

• 细胞、细菌的整体形态、表面突起和细胞间相互关系
• 消化道、呼吸道、血管等空腔组织的表面结构
• 植物、昆虫等
• 生物材料复合体