细胞培养的基本技术与知识-香草杏仁

基本技术

细胞的分离和原代培养

猪VICs的分离培养（以我自己使用的原代细胞为例）

将4-6月龄的猪使用丙泊酚诱导麻醉后，静脉注射氯化钾处死；
开胸后分离结扎主动脉、上腔静脉、下腔静脉，摘除心脏，寻找主动脉根部并分离主动脉瓣的瓣叶（分离冠脉内皮细胞需将儿童导尿管从冠状动脉窦插入冠脉，之后沿导尿管走形分离）；
将瓣叶剪下后置于含3%青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基（无血清）中，迅速转运至实验室；
使用含3%青霉素/链霉素的PBS洗涤瓣叶3次，洗去瓣叶上残留的血液，将瓣叶置于青霉素/链霉素溶液中静置5分钟：
配置2mg/ml的Ⅱ型胶原酶溶液，将瓣叶放入Ⅱ型胶原酶溶液中置于37℃、5%CO2培养箱中消化20分钟，使用无菌棉签刮除猪VECs；
将刮除猪VECs的瓣叶剪碎放入II型胶原酶溶液中，37℃、5%CO2培养箱中消化4小时；
猪VICs完全培养基的配制：DMEM高糖培养基+55ml FBS+5ml 青霉素/链霉素溶液+5ml HEPES+5ml Glutamax；
使用无菌吸管将含有猪VICs的Ⅱ型胶原酶溶液反复吹打，1000rpm离心5分钟；
弃去II型胶原酶溶液，使用含10% FBS的DMEM高糖培养基重悬细胞，将猪VICs接种于 T25 培养瓶中，每隔两天进行换液。

细胞传代

镜下观察细胞状态佳且长满皿，弃上清，用 2ml 1×PBS 漂洗，弃去；
加入 1ml 胰酶，RT静置消化 1min，待观察到大部分贴壁细胞脱落时，立即加入 3ml 完全培养基终止消化，收集，RT离心（1000rpm，5min）；
弃上清，用1ml完全培养基重悬；
1:3传代：均分三份加至预先加有 9ml 复温的完全培养基的 10cm dish 中；
轻摇混匀细胞，RT静置 2min，镜下观察后放回培养箱培养（37℃，5%CO2）。

细胞计数（传统人工法）

细胞个数（个/ml）=（4个大格总数/4）× 10000 × 稀释倍数

细胞活力检测：活细胞对 0.4% trypan blue 拒染

细胞冻存

镜下观察，细胞状态佳且快长满皿，弃上清，用 2ml 1×PBS 漂洗，弃去；
加入 1ml 胰酶，RT静置消化 1min，待观察到大部分贴壁细胞脱落时，立即加入 3ml 完全培养基终止消化，收集，RT离心（1000rpm，5min）；
弃上清，用 3ml 冻存液重悬，分装至冻存管中（1ml/管），标记（细胞名称、代数、冻存时间、姓名）。
装入异丙醇-梯度冻存盒（预先复温至室温），置于 -80℃ 过夜/临时保存。可转移至液氮中长期保存。

细胞要“慢冻快融”！故冻存时需要使用梯度冻存。

自配冻存液配方
- 70%DMEM + 20%FBS + 10%DMSO
- 90%FBS + 10%DMSO
DMSO最后加！常温避光保存。

在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成结晶，影响细胞功能甚至死亡，冻存失败。培养基中加入保护剂: 甘油或二甲基亚砜DMSO

细胞复苏

紫外预照生物安全柜 30min；
从液氮或 -80℃ 冰箱取出细胞，37℃ 水浴快融；
取 15ml 离心管，加入 3ml 完全培养基，将融化的细胞加入离心管混匀，离心 1000rpm，5min，
预先在10cm dish中加入复温的8ml完全培养基；
用 2ml 完全培养基重悬细胞，加入皿中；
摇匀细胞，RT静置2min，镜下观察后放回培养箱培养（37℃，5%CO2）。

附：常用培养基及添加剂

基本知识

体外培养细胞的特点

无神经体液调节
无其他类型细胞的影响
与体内细胞结构和功能的差异
失去原有形态、分化特性减弱

容器

培养容器的容积、细胞数

细胞的类型及其特点

黏附型 adhesive cell

贴附于支持物表面，单层生长
失去在体内的原有形态
反映胚层起源情况
有接触抑制和密度依赖特征
大多数细胞属于此型

黏附型

悬浮型 suspensory cell

不贴附于支持物表面，以悬浮状态生长
单个分散成团
各种源自血液的细胞、骨髓、脾细胞

悬浮型

培养细胞的增殖过程

传代 passage

细胞在培养容器中增殖到一定密度，生存空间及营养物质缺乏，需要按一定比例分离，接种至新的培养容器并更新
一代：细胞接种后到下一次传代的一段时间；可增殖几次
培养细胞一代的三个阶段：潜伏期、指数增长期、平台期

实验研究多在指数增长期进行

培养细胞的生命期 lifespan

原代培养：从体内取出细胞接种后到第一次传代。一般维持1-4周。
传代期：原代细胞一经传代就成为细胞系（cell line），进入传代期，持续时间最长，一般传10~50代。（Hayflick极限）
衰退期：细胞增殖缓慢、停止至死亡。

Hayflick极限

原代细胞一经传代即进入传代期，一般体外培养平均维持30代。大多数正常细胞在传代10~50次后，细胞分裂能力就会逐渐减弱，传代次数有一定的极限，与细胞来源机体的年龄、物种的特性有关，这个传代次数的的界限称为Hayflick极限，揭示了细胞存在的内在衰老机制，即因DNA复制和细胞增殖次数过多而出现的衰老机制。