细胞生物学技术考前参考-香草杏仁

核心重点（非官方）

选择题

高严格度条件
不同离心方法的适用性
沉降系数、离心力与什么因素有关？
转录因子重编程
检测细胞增殖或凋亡的手段及检测方法
流式的几个对照组

名词解释

透射电子与二次电子

电子显微镜以电子射线作为照明光源，以电磁场作为透镜，具有高分辨率和放大倍率的显微镜。电镜用于研究组织和细胞的超微结构。

透射电子（transmission electron）：当样品厚度小于100nm时，部分电子可穿透样品，将穿透样品的电子叫做透射电子，利用透射电子信息成像的称为透射电镜。

二次电子（Second electron）：在入射电子的轰击下，样品表面5～50nm深度激发出来的电子称为二次电子，利用二次电子信息成像的称为扫描电镜。
细胞化学技术

在保持细胞结构完整的条件下，借助细胞中的化学反应在细胞原位确定化学成分的分布、量及其在细胞活动中的动态变化的技术，达到定性、定位和相对定量的目的，用以阐明化学成分在细胞中的功能、与疾病的关系，或指示细胞的状态等。
严格度（严谨度）

决定探针是否与含不相配碱基的核酸序列结合的条件，是决定杂交双链间形成氢键稳定性的条件，也是最终影响特异性的反应条件。

高严格度条件：碱基完全互补的双链才能形成杂交体（高温度、高甲酰胺浓度、低离子强度）

低严格度条件：碱基不完全互补的双链也能形成杂交体
hayflick极限

原代细胞一经传代即进入传代期，一般体外培养平均维持30代。大多数正常细胞在传代10~50次后，细胞分裂能力就会逐渐减弱，传代次数有一定的极限，与细胞来源机体的年龄、物种的特性有关，这个传代次数的的界限称为Hayflick极限，揭示了细胞存在的内在衰老机制，即因DNA复制和细胞增殖次数过多而出现的衰老机制。
报告基因

是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控。
原位杂交

将分子生物学技术与细胞化学技术相结合，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位与细胞内需探测的核酸杂交, 检测特异核酸分子的技术。结果既可以反映特异核酸分子的量，又可以反映核酸与组织、细胞、细胞器或染色体的位置关系。
光漂白、光淬灭
- 光漂白(Bleaching)：荧光素被多次照射后，发射光也会消失
- 光淬灭(Quenching)：荧光素放置过久或接触某些化学物质，光消失

主观题

新鲜实体组织的流式样本制备 / 单细胞悬液的制备方法

对于不同组织来源的实体组织和实体瘤标本，应该根据各自特点选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产量高、损伤小、杂质少的目的。常用方法有：
- 机械法：剪碎法、网搓法、研磨法等。利用机械方法、物理方法给予组织较大的压力，使细胞从组织间分散开来。同时尽量增加酶或化学试剂与标本接触的面积。
- 酶消化法：酶解细胞外基质以及细胞之间的连接，根据分散组织类型来确定使用的酶类包括
  - 胰蛋白酶—水解酯键、肽键；
  - 胶原酶—降解几种分子类型的胶原；
  - 溶菌酶—水解糖蛋白、肽的糖苷键；
  - 弹性蛋白酶—消化糖蛋白、弹性蛋白的纤维;
  - 透明质酸酶
- 化学试剂处理法：将组织细胞间起黏着作用的钙、镁离子置换出来，从而使细胞分散开来，常用试剂有EDTA、EGTA、TPB等。EDTA是一种螯合剂，可以和组织间的钙、镁离子形成螯合物，实际运用中常采用螯合物加酶法（主要是胰蛋白酶）
实际工作中经常是三种方法配合使用，应根据实验目的不断优化条件。
解释LSCM的工作原理
基本原理：
- 激光光源：光色纯、方向性好（点光源）、亮度高
- 扫描样品：断层、逐点、逐行扫描 “CT”
- 共聚焦成像：双针孔（光源针孔、检测针孔）
- PMT对图像的探测和数字信号转换
优点：高分辨率、高对比度

局限：成像速度慢、观测厚度：50~100μm、分辨率极限0.15μm
电镜超薄切片取材的要点
- 快：1分钟内固定，尽可能保持其生活状态，因为瞬间的拖延都会导致细胞超微结构的变化
- 小：约1mm³的小块，组织块过大其中央得不到及时固定会发生细胞自溶现象
- 轻：不要牵拉、锯、挤压组织，避免细胞受到损伤
- 冷：低温操作，4℃保存，降低酶的活性，避免组织发生自溶
分析检测蛋白质相互作用的几种技术的不同

Yeast 2、GST-pulldown、Co-IP、IF、FRET
核酸导入方法比较

	脂质体法	病毒法	电转法
转染方式	稳转、瞬转	稳转、瞬转	稳转、瞬转
靶细胞	所有细胞	宿主细胞	所有细胞
特点	1. 方法简单 2. 可携带大片段DNA 3. 没有免疫原性（但有细胞毒性） 4. 有时候转染效率不高	用于难转染的细胞，需要考虑安全因素	转染效率高，但致死率高