经验证，人类样本的单细胞分析使用seurat教程的方法计算线粒体序列比例与此方法结果一致，但对于其他物种，建议使用此方法。

使用注释文件生成线粒体计数指标

我们将使用AnnotationHub，它允许加入各种各样的在线数据库和其他资源，以查询通过ensembldb提供的Ensembl注释。Ensembldb是一个软件包，可以直接从Ensembl检索数据库的注释。

安装AnnotationHub和ensembldb包

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
    install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("AnnotationHub")
BiocManager::install("ensembldb")

library(AnnotationHub)

# 阅读自带文档
browseVignettes("AnnotationHub")

下载相应物种的数据集

要访问Ensembl为人类提供的各种注释，我们需要首先连接到AnnotationHub，然后指定我们感兴趣的物种和数据库。

# Connect to AnnotationHub
ah <- AnnotationHub()

# Access the Ensembl database for organism
ahDb <- query(ah, 
              pattern = c("Homo sapiens", "EnsDb"), 
              ignore.case = TRUE)

接下来，我们从这个Ensembl数据库获取最新的注释文件。

我们可以先检查哪些注释版本可用：

# Check versions of databases available
ahDb %>%
  mcols()

由于我们想要最新的，我们将返回这个数据库的AnnotationHub ID：

# Acquire the latest annotation files
id <- ahDb %>%
  mcols() %>%
  rownames() %>%
  tail(n = 1)

最后，我们可以使用AnnotationHub连接下载相应的Ensembl数据库，其版本应该是GRCh38.92：

# Download the appropriate Ensembldb database
edb <- ah[[id]]

提取基因的信息，我们可以使用Ensembldb函数genes()来返回注释的数据框：

# Extract gene-level information from database
annotations <- genes(edb,
                     return.type = "data.frame")

提取线粒体基因ID

注释文件中信息很多，我们只需要提取我们需要的列：

# Select annotations of interest
annotations <- annotations %>%
  dplyr::select(gene_id, gene_name, gene_biotype, seq_name, description, entrezid)

View(annotations)

这一步可以保存一下这个注释文件，以便下次使用：

saveRDS(annotations, file = "data/annotations.rds")

现在我们可以检索到与感兴趣的不同生物型相关的基因：

# Extract IDs for mitochondrial genes
mt <- annotations %>%
        dplyr::filter(seq_name == "MT") %>%
        dplyr::pull(gene_name)

将参数添加到元数据中

# Number of UMIs assigned to mitochondrial genes
counts <- bav_merged@assays$RNA
metadata$mtUMI <- Matrix::colSums(counts[which(rownames(counts) %in% mt),], na.rm = T)

# Calculate of mitoRatio per cell
metadata$mitoRatio <- metadata$mtUMI/metadata$nUMI