Sortilin enhances fibrosis and calcification in aortic valve disease by inducing interstitial cell heterogeneity-香草杏仁

主要研究结果

SORT1与AS的遗传关联

对SORT1基因组50kb范围的555个变体进行meta分析：

11个变体与AS显著相关，但可能仅包含一个独立的信号

sortlin缺失减弱主动脉瓣狭窄的发展并减少主动脉瓣纤维化和钙化

团队前期研究证明了sortlin在血管钙化中的作用（PMID: 26950419）

模型构建：Ldlr^−/−^*/Sort1^+/+^ and Ldlr^−/−^/Sort^−/−*^ littermates were fed a HF/HC diet and underwent AVWI, sham procedure (ligation of carotid artery) or no procedure (NP) (n ≥ 10).

通过原子力显微镜观察，Ldlr−/−/Sort1+/+小鼠的AV小叶硬度显著高于Ldlr−/−/Sort1−/−小鼠(P < 0.01)

胶原：天狼星红染色

用多光子和共聚焦显微镜观察所有三个主动脉瓣小叶的钙化分子成像。

A-D: Left ventricular ejection fraction (LV-EF), left ventricular end-diastolic diameter (LVEDD), left ventricular end-systolic diameter (LVESD), and end-diastolic interventricular septum thickness (IVSed) across study groups, respectively. E, F: Aortic valve regurgitation (AR) grade and heart weight at 16 weeks post aortic valve wire injury (AVWI) or sham procedure. G, H: Heart rate at the time of the echocardiographic exam and body weight across study groups, respectively.

钙化的主动脉瓣病组织中，在纤维化和钙化的区域内发现了Sortilin

患者标本做组织学检测，并用于获取原代VIC

在纤维化和钙化区域附近发现Sortilin

VIC在OM中扩增后scRNA-seq，检测到11个亚群

研究Sortilin在VIC内的定位，发现OM培养后大量定位在反式高尔基体，同时表达出大量SMA。si沉默后表达降低，SMA水平也随之下降

与CM相比，OM培养的VICs在培养21天内Sortilin mRNA和蛋白表达增加(P < 0.05)，而siSORT1沉默后则降低(P < 0.0001)。

==通过体内+体外实验证明Sortilin在钙化后升高。==

一组VIC亚群获得了成肌-成骨表型

培养第21天，流式鉴定出三个不同大小和粒度的主要VIC群体

不同培养基中[OM（橙色）、CM（蓝色）和补偿对照（红色）]的重叠直方图显示，VICs中的vimentin、sortilin、α-SMA、骨膜蛋白、骨钙素和ALP的表达增加了

与CM相比，OM中发现了更多的sortilin和肌成纤维细胞和成骨相关标记物双阳性VICs

单个t-SNE图突出了sortilin表达较高的簇，同时伴有α-SMA、波形蛋白、骨桥蛋白和骨钙蛋白的表达

FlowSOM算法确定了19个VIC亚群，它们具有不同的sortilin、vimentin、α-SMA、osteopontin和osteocalcin的表达。

在OM中培养的VIC至少有6个亚群，而在CM中只有3个亚群属于VIC的肌成纤维-骨成纤维相关表型。

在第21天为流式细胞仪处理的全部VICs，根据密度图被分为三个主要门类。与P1和P3门的纺锤形vic相比，P2门的瓣膜间质细胞显示成骨细胞样形态。

P2门的瓣膜间质细胞在OM与CM相比（P<0.001），以及与P1和P3门相比（P<0.001），sortilin的表达明显增加。

与CM相比，P2门的vic降低了OM中vimentin的表达(P < 0.01)，但增加了α-SMA、骨钙素和ALP的表达(P < 0.05)。表明成纤维细胞表型减弱而转为成肌-成骨表型

与CM相比在OM中培养的VIC增加了COL1A1、ACTA2和ALPL的mRNA水平的表达（P < 0.05）。

==这些结果表明，在成骨环境中，VICs增加了sortilin的表达，其中VICs的一个亚群分化为肌成纤维-成骨表型，标志是COL1A1、α-SMA、骨钙素和ALP的表达增加。==

Sortilin介导的肌成纤维细胞瓣膜间质细胞激活部分受MAPK和YAP信号调节，也与成骨表型的ALP表达有关

为了进一步研究sortilin在肌成纤维细胞活化和钙化中的作用，在CM和OM中培养21天时，用siSORT1同时对VICs进行sortilin沉默。免疫荧光成像发现，在OM中培养的VIC在第14天时，α-SMA和COL1A1的表达量增加，siSORT1减弱了这种情况。

根据文献，探讨了p38 MAPK和YAP/TAZ的表达。

在siSORT1之后，肌成纤维细胞相关的转录水平（COL1A1、ACTA2、TAGLN和MAPK11）的增加明显减少（P < 0.001）。

加入p38 MAPK抑制剂（SB203580），可显著降低肌纤维细胞激活基因的表达，包括ACTA2、钙蛋白（CNN1）、肌球蛋白重链11（MYH11），同时也可降低分泌的COL1A1（P < 0.05）。

==这些结果表明，sortilin部分地与MAPK和YAP信号途径相关联，这可能是VIC分化为成肌-成骨表型的一个调节剂。==

为了研究VICs的成骨特性，分别通过qPCR、免疫荧光成像、ELISA和茜素红染色来评估ALP表达、ALP活性和体外钙矿物沉积。VICs在OM培养中与CM相比，ALP的表达量增加（P < 0.0001），在siSORT1之后，ALP的表达量明显减少（P < 0.0001）（图4B）。VICs的免疫荧光成像证实了ALP和sortilin信号的共同表达，在siSORT1之后，ALP和sortilin信号减少（图4C）。VICs在OM与CM中的ALP活性增加（P < 0.0001），在siSORT1之后，ALP活性下降（P < 0.05）（图4D）。Alizarin红染色发现，在OM与CM中，sortilin介导的钙矿物质沉积明显增加（P < 0.01），而在siSORT1之后，这种沉积减少（P < 0.05）（图4E）。