ATVB：多组学揭示CAVD基质细胞状态变化与INHBA相关重塑

英文题目：Multiomics Analysis Reveals Stromal Cell State Changes and INHBA-Associated Remodeling in Calcific Aortic Valve Disease

作者：Shilin Jin, Shishi Wu, Feng Shen, Chen Meng, Jidan Fan, Meilin Shu, Dandan Zhao, Di Yang, Mengyao Yu

期刊：Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology（ATVB）

年份与卷期：2026; 46:e324799

DOI：10.1161/ATVBAHA.126.324799

文章类型：Original Research

核心科学问题

1. 胎儿、非病变和钙化主动脉瓣之间，VIC、VDSC 和 VEC 的细胞状态如何变化？
2. CAVD 遗传风险主要落在哪些瓣膜细胞状态和候选基因上？
3. INHBA 是否参与 VIC 的成骨样重塑和钙化？

引言

CAVD 的临床与机制背景

• CAVD 是常见的瓣膜疾病，仍缺少能够阻止疾病进展的药物治疗。
• 正常瓣膜形成依赖心内膜垫细胞、神经嵴来源细胞和第二心场来源细胞，并经历持续的细胞外基质（ECM）分层和重塑。
• 健康瓣膜中的 VIC 多处于静息状态；机械或炎症刺激可使其转为活化的肌成纤维样状态，并增加 ECM 合成。
• 胎儿瓣膜发育和 CAVD 都会出现细胞活化及 ECM 重塑，但相似信号在生理发育和病理钙化中的具体作用可能不同。

现有认识与研究空白

• 既往研究已分别描述胎儿、健康和病变瓣膜的单细胞图谱，但缺少跨阶段的系统整合。
• CAVD GWAS 已发现多个风险位点，但大量变异位于非编码区，难以直接确定其作用的细胞类型和调控基因。
• 单细胞数据能够提供细胞状态分辨率，但数据稀疏、跨队列差异和供体数量有限，使遗传风险映射存在困难。
• INHBA 编码 activin/inhibin 的 βA 亚基，属于 TGF-β 超家族。它与纤维化、细胞分化和组织重塑有关，但其在 CAVD 中的作用尚不明确。

研究假设与目标

作者假设，瓣膜发育与 CAVD 之间存在部分共享但具有情境依赖性的基质细胞程序；通过整合 scRNA-seq、GWAS 和 bulk RNA-seq，可以识别 CAVD 相关细胞状态及候选基因，并进一步在 VIC 钙化模型中验证候选分子的功能。

关键术语

本文的主要研究结果

1. 跨阶段单细胞图谱显示 CAVD 瓣膜发生以 VDSC 扩增为核心的细胞组成重塑

作者首先使用 Seurat 和 Harmony 整合三个阶段的主动脉瓣 scRNA-seq：胎儿瓣膜 2 例（孕 15 周，6,073 个细胞）、健康参照瓣膜 5 例（方法部分报告平均年龄 15.2 岁，39,406 个细胞）和重度 CAVD 瓣膜 4 例（平均年龄 53 岁，39,031 个细胞），共纳入 84,510 个高质量细胞。随后再通过亚群分析、细胞通讯、GWAS 和 bulk RNA-seq 逐步定位疾病相关细胞状态及候选基因（Figure 1A–B）。

论文多处使用 “healthy adult” 表述，但方法部分报告健康组平均年龄为 15.2 岁，因此本笔记暂称其为“健康参照组”。

三组细胞在 UMAP 上的分布明显不同，提示疾病状态伴随显著的细胞组成或转录状态改变；进一步聚类得到正文所述的 14 个转录簇（Figure 1C；Figure S1E）。

根据 COL1A1、DCN、TIMP3、SPARC、FN1、PECAM1、CSF1R、CD68、CD3D、CD3E、TPSAB1 和 TPSB2 等标志基因，作者将这些转录簇归并为 VIC、VDSC、VEC、巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞 6 类主要细胞。六类细胞在 UMAP 上总体可分，VIC 与 VDSC 相邻但不完全重叠，提示二者同属基质细胞范畴但具有不同的转录状态（Figure 1D–E；Figure S1F；Table S4）。

细胞组成比较显示，胎儿和健康参照瓣膜主要由 VIC 构成，而 CAVD 样本中 VDSC 成为绝对优势群体，占全部细胞的 86.9%；胎儿样本中则没有检出 VDSC。Sankey 图中的“流向”表示不同阶段细胞与注释类型之间的对应关系，不代表同一细胞在时间上发生真实转分化（Figure 1F；Table S6）。

各主要细胞类型也呈现不同的功能程序：VIC 主要富集细胞外结构和 ECM 组织，VEC 偏向血管生成和发育，巨噬细胞偏向髓系白细胞激活，VDSC 则同时富集免疫反应、白细胞介导免疫、炎症细胞迁移和胞质翻译。这说明 CAVD 中的 VDSC 改变不仅表现为数量扩增，也具有炎症和组织重塑相关的转录特征（Figure 1G；Table S7）。

2. VIC 从胎儿发育相关状态转向健康及 CAVD 相关状态，但伪时序不能证明真实谱系转换

胎儿、健康参照和 CAVD 的 VIC 具有不同的转录程序。胎儿 VIC 主要富集有丝分裂、细胞分化和上皮-间质转化；健康参照 VIC 更突出 TGF-β、WNT/β-catenin、氧化磷酸化和脂肪酸代谢；CAVD VIC 则富集 TNFα/NF-κB、MYC、mTORC1 和凋亡相关信号，并出现 INHBA、IL6 和 CXCL8 等高表达候选基因（Figure 2A；Figures S2A–S2D）。

三组 VIC 分别富集 825、1,436 和 771 个 GO-BP 条目，其中三组共有 56 个，胎儿与 CAVD 额外共有 227 个。这些共享条目涉及 TGF-β receptor、p38 MAPK、糖酵解、miRNA 代谢、胰岛素反应和 ossification，但三组仍保留大量阶段特异程序。因此，胎儿发育与 CAVD 只能说共享部分重塑信号，不能据此认为病理钙化完整重演了胎儿发育（Figure 2B；Figures S2E–S2G；Tables S8–S9）。

重新聚类后，VIC 被分成 VIC1–VIC6。二维和三维降维结果都显示 VIC1/2 构成主体，VIC3 和 VIC5 形成相对独立的发育相关群体，VIC4 位于主体边缘，VIC6 为较小群体（Figure 2C–D）。

不同阶段的亚群组成存在明显重排：胎儿 VIC 主要由 VIC3 和 VIC5 构成，健康参照组主要为 VIC1 和 VIC2，CAVD 中同样以 VIC1/2 为主且 VIC2 比例更高。组织偏好分析得到相同方向，VIC3/5 偏向胎儿，VIC1 偏向健康参照，VIC2 偏向 CAVD，VIC4 也具有一定健康偏好（Figure 2E–F）。

VIC2 同时表达 IGFBP7、CCL2、MT2A、TAGLN 和 ACTA2，兼具炎症与收缩/结构重塑特征，与其在 CAVD 中的扩增相符。VIC1/2 整体偏向 ECM 和 extracellular structure organization；VIC3/5 更接近心脏、肌肉发育和收缩程序；VIC6 则富集 chromosome segregation、mitotic division 和 organelle fission，符合小型增殖状态的特征（Figure 2G–H；Table S5）。

Monocle 2 与 CytoTRACE 2 将这些状态排列为胎儿相关 VIC3、VIC1，再到 CAVD 中积累的 VIC2，并显示其他亚群分布在不同分支。作者在正文中也强调，该轨迹反映跨条件的阶段相关转录差异，而不是已经证明的连续发育或疾病谱系（Figure 2I；Figures S2H–S2K）。

3. CAVD 中 VDSC1 和 VDSC3 显著扩增，并分别偏向炎症趋化与结构重塑

CAVD VDSC 的整体转录程序显著偏向炎症和髓系细胞募集。GSEA 显示 inflammatory response（NES=2.369，adjusted P=3.13×10^-4）、myeloid leukocyte migration（NES=2.186）、myeloid leukocyte activation（NES=2.027）和 leukocyte migration（NES=1.861）均为正向富集（Figure 3A）。

作者将 VDSC 进一步分为 VDSC1–VDSC6。VDSC1 与 VDSC3 在转录空间中相邻，VDSC2 与 VDSC4/5 构成另一主体，VDSC6 为极少数细胞。（Figure 3B、3F；Figures S3A–S3B）。

健康参照组共有 2,696 个 VDSC，主要由 VDSC2 和 VDSC4 构成；CAVD 组共有 35,335 个 VDSC，其中 VDSC1 和 VDSC3 明显扩增。Milo 邻域分析同样显示，大量邻域在 CAVD 中富集，而健康富集邻域集中在状态空间的另一端；VDSC2/4 内部仍同时存在疾病与健康相关邻域，提示离散亚群内部还有连续异质性（Figure 3C–E）。

VDSC1 高表达 CXCL1、CXCL2、CXCL3、CCL20 和 G0S2，并富集 TNF、IL-17、NF-κB 和 cytokine–cytokine receptor interaction，符合炎症和趋化相关状态。VDSC3 则表达 FILIP1L、CDC42SE1 等结构相关基因，并富集 adherens junction、phospholipase D、sphingolipid signaling 和肌细胞骨架相关通路，更偏向结构与黏附重塑。少量 VDSC5 也表达 IL6、CXCL8、TNFAIP6、LIF 和 THBS1；VDSC6 的成骨与矿化通路证据位于补充材料中（Figure 3F–G；Figure S3C）。

同名亚群在健康与 CAVD 中也并非功能完全相同。健康 VDSC2 主要富集 ECM assembly、fiber organization 和 actin filament organization，而 CAVD VDSC2 转向 cytoplasmic translation、ribosome biogenesis、oxidative phosphorylation 等程序（Figure 3H）。

健康 VDSC4 偏向 cell-substrate adhesion、actin filament 和 ECM organization；CAVD VDSC4 则偏向 cytoplasmic translation、ribonucleoprotein complex biogenesis、apoptotic signaling 调控和 response to lipopolysaccharide。（Figure 3I）。

伪时序进一步把健康相关 VDSC2/VDSC4 和疾病相关 VDSC1/VDSC3 排列在不同分支，支持“不同条件下的基质细胞状态重新分布”，但不能证明 VDSC2/4 在个体内转分化为 VDSC1/3（Figure 3J）。

4. CAVD 的整体推定通讯网络减弱，但 VDSC1–巨噬细胞和胶原信号相对突出

CellChat 结果显示，CAVD 组的推定 interaction number 和 interaction strength 均明显低于健康组。因此，CAVD 的特点不是所有细胞通讯普遍增强，而是整体网络收缩并伴随部分通讯边选择性突出（Figure 4A）。

健康组中 VIC1 的 incoming/outgoing strength 最突出，VIC2 和巨噬细胞次之；CAVD 组中 VDSC1 的 outgoing strength 较高，而巨噬细胞的 incoming strength 最突出。差异矩阵也显示 VDSC1 作为发送者对多个细胞群的信号增强，而部分 VIC1 相关连接减弱，提示网络中心从健康 VIC 状态转向病变 VDSC1–巨噬细胞轴（Figure 4B–C）。

在 VDSC1 的差异信号中，COLLAGEN 和 FGF 位于较高变化区域，另有 FN1、SELE、PTN、CCL、MIF 等 ECM、黏附或炎症相关信号。这说明 VDSC1 的疾病相关通讯改变以胶原/基质重塑和生长因子信号较为突出（Figure 4D）。

在 COLLAGEN signaling 内部，COL6A2–CD44 的相对贡献最大，COL1A2–CD44 次之，其他 COL6A2/1A1/1A2–SDC4 或 CD44 组合贡献较小。网络图进一步显示 VDSC1 是较突出的外向信号节点，并与多种基质、免疫、内皮和 VIC 亚群相连（Figure 4E–F）。

5. 遗传风险与疾病转录程序两条独立分析路线均将 CAVD 相关性定位到 VDSC

作者首先使用 scPagwas，将 10 个队列中 13,765 例 CAVD 病例和 640,102 例对照的 GWAS 信号映射到单细胞。高 trait-relevance score 主要集中在 VDSC；正文报告 VDSC 整体显著富集（P=6.68×10^-10），其中 VDSC1（P=1.18×10^-11）和 VDSC3（P=1.11×10^-9）的信号最强，与前述疾病相关亚群结果相互印证（Figure 5A–B；Figure S5A；Table S3）。

Trait-Relevance Score，即“性状相关性评分”。在这篇论文中，“性状”指 CAVD/主动脉瓣狭窄的遗传风险。TRS 越高，说明该细胞正在表达的转录程序，与 GWAS 所提示的 CAVD 遗传相关程序越一致。

通过计算基因表达与 trait-relevance score 的 Pearson correlation coefficient，作者以 PCC>0.2 为阈值得到 49 个 scPagwas 候选基因。CXCL8、SOD2、IL6、MT2A、CXCL1、INHBA、SERPINE2、CMSS1 和 IER3 等位于正相关前端（Figure 5C；Table S11）。

作为独立的转录组证据路线，作者使用 scAB，将 6 个 GEO bulk RNA-seq 数据集中的 44 个钙化瓣膜和 38 个健康瓣膜所代表的疾病转录程序投射到单细胞。作者共识别 4,370 个 scAB+ 细胞，红色阳性细胞主要集中在 VDSC 区域，其中约 80% 为 VDSC，VIC 约占一成，其余细胞类型比例较低（Figure 5D–E；Table S2）。

scAB+细胞指表达状态与 bulk RNA-seq 中反复出现的 CAVD 疾病表达程序高度一致的细胞。

scAB+ 与其他细胞之间共得到 110 个差异基因。上调侧包括 FTH1、CST3、MT2A、MT1X、SOD2、CLU、IL6、INHBA 和 CXCL8，下调侧包括 RANBP17、MAGI1、TENM3 和 DENND2A，整体指向炎症、氧化应激和基质重塑相关状态（Figure 5F；Table S12）。

scPagwas 和 scAB 的交集包含 21 个候选基因：CXCL8、SOD2、MT2A、IL6、INHBA、SERPINE2、CMSS1、TXN、FTH1、GLIS3、TNFAIP6、DDX21、CTSL、BASP1、TM4SF1、G0S2、LIF、FST、PTGS2、SELENOS 和 EIF5B（Figure 5G；Table S13）。

这些候选基因整体在 CAVD 中表达较高，并主要定位于 VDSC；其 GO 功能集中于 inflammatory response、immune response、chemotaxis、neutrophil chemotaxis、chemokine-mediated signaling、胞质翻译和细胞增殖调控，与 VDSC1 的炎症表型一致（Figure 5H–I）。

6. INHBA 呈“胎儿高—健康低—CAVD 再升高”的阶段模式，并参与体外 VIC 成骨样重塑

在 21 个候选基因中，INHBA 显示最突出的阶段相关表达模式。胎儿到健康的伪时序中，INHBA 随胎儿相关 VIC3/VIC5 向健康相关状态排列而下降；健康到 CAVD 的伪时序中，INHBA 随 VIC2/VDSC2 向 VDSC1 相关状态排列而升高，两组比较均为 P<0.0001（Figure 6A–B；Figures S6A–S6B）。

在人原代 VIC 的体外模型中，普通培养基（CM）或成骨培养基（OM）培养 14 天后，OM 组 INHBA（P=0.0182）、RUNX2（P=0.0002）和 ALP（P=0.0323）蛋白均升高。补充结果还包括茜素红和 RUNX2 对成骨模型的确认、INHBA mRNA 及免疫荧光变化（Figure 6C；Figures S6C–S6E）。

在 OM 条件下使用 siRNA 敲低 INHBA 后，INHBA（P<0.0001）、RUNX2（P=0.0096）和 ALP（P=0.0225）蛋白均下降。茜素红染色减少，RUNX2 免疫荧光强度也降低（P=0.0017），说明降低 INHBA 可以减弱该培养体系中的成骨样分子表型和矿化表型（Figure 6D–E；Figure S6F）。

为了在组织层面观察 INHBA 的阶段性表达，作者比较了 E16.5 胎儿小鼠（n=3）与雄性 ApoE−/− 健康和 CAVD 模型小鼠（各 n=3）；CAVD 组从 10 周龄起接受高脂高胆固醇饮食 9 个月，并通过组织学检测 RUNX2 和 INHBA。INHBA 在小鼠瓣膜中同样表现为胎儿较高、健康降低、CAVD 模型再次升高；胎儿与健康比较 P=0.0044，健康与 CAVD 比较 P=0.0008。RUNX2 的阶段性组织表达主要位于补充材料（Figure 6F；Figure S6G）。

TGF-β1（4 ng/mL）刺激可提高 INHBA、RUNX2 和 ALP，siINHBA 则减弱 TGF-β1 诱导的三种蛋白升高。图中相应比较的 P 值约为 INHBA 0.0285/0.0261、RUNX2 0.0297/0.0283、ALP 均<0.0001，支持 INHBA 参与 TGF-β 相关的 VIC 成骨样反应（Figure 6G）。

OM 条件下的 siINHBA RNA-seq 共得到 567 个差异基因，其中 424 个上调、143 个下调。上调基因涉及心脏收缩、肌肉系统过程和心脏发育，下调基因涉及成骨分化、骨化和代谢；PPI 分析把 INHBA 与 SMAD7、RUNX2 置于同一网络，但作者也承认该机制尚未在 VIC 中直接验证（Figures S7A–S7D）。

结论（要点归纳）

1. 胎儿、健康参照和 CAVD 瓣膜存在显著不同的 VIC、VDSC 和 VEC 转录状态分布。
2. VDSC1 是 CAVD 中显著扩增的炎症和 ECM 重塑相关细胞状态，VDSC3 更偏结构重塑。
3. 细胞通讯分析提示 VDSC1–巨噬细胞和 collagen signaling 在 CAVD 中相对增强。
4. scPagwas 与 scAB 将 CAVD 遗传及转录风险主要定位到 VDSC，并共同筛得 21 个候选基因。
5. INHBA 在胎儿和 CAVD 瓣膜中呈阶段相关性高表达。
6. 体外敲低 INHBA 可降低 RUNX2、ALP 和钙沉积，但体内因果性及具体下游机制尚未确定。

原文讨论

作者强调的贡献

• 以胎儿、健康参照和 CAVD 三个条件建立跨阶段主动脉瓣单细胞图谱。
• 提出 VIC 和 VDSC 之间存在紧密关联的阶段性细胞状态变化。
• 将 VDSC1 确定为 CAVD 中稳定富集的炎症和 ECM 重塑相关状态。
• 通过 GWAS、bulk RNA-seq 和 scRNA-seq 的整合，把遗传风险连接到具体基质细胞状态。
• 将 INHBA 提出为与 CAVD 成骨样重塑相关的候选分子，并提供体外功能证据。

作者承认的局限性

1. GWAS 与 bulk RNA-seq 主要来自欧洲人群，scRNA-seq 主要来自亚洲样本，需要跨族群验证。
2. INHBA 在 VIC 钙化和炎症中的具体下游机制没有被完整解析。
3. 单细胞定义的细胞亚群需要进一步实验验证其身份和功能。
4. 除 INHBA 外，其余 20 个候选基因尚未进行功能验证。
5. VDSC 与免疫细胞之间的复杂互作没有得到充分解析。

我的讨论

文章的整体逻辑

文章的主线较清楚：

跨阶段细胞图谱发现基质状态变化 → VDSC1/VDSC3 与 CAVD 关联 → GWAS 与转录组双方法筛选候选基因 → 根据阶段表达选择 INHBA → 体外敲低验证钙化表型 → 小鼠组织验证表达模式

逻辑上的主要缺口位于最后两步：体外敲低证明 INHBA 对培养体系中的成骨表型有贡献，但小鼠部分只做表达验证，没有完成体内功能干预。因此文章标题使用 “INHBA-associated remodeling” 比直接宣称 INHBA 驱动 CAVD 更符合证据。

创新性

• 实验设计的创新：把胎儿瓣膜发育状态与 CAVD 病理状态放在同一细胞图谱中比较，同时强调共享通路的情境依赖性。
• 使用较新的生信分析工具：使用 scPagwas 和 scAB 两种不同整合框架，从遗传风险和 bulk 疾病程序两个方向定位相关细胞。

可能存在的局限性

1. 年龄和队列混杂明显：胎儿为孕 15 周，健康组方法中报告平均 15.2 岁，CAVD 组平均 53 岁；年龄、疾病、批次和样本来源难以完全分离。
2. 供体数量有限：单细胞共有 84,510 个细胞，但生物学重复仅为 2、5 和 4 个供体。细胞数量不能替代供体层统计。
3. VDSC 身份需要验证：VDSC 可能代表 VIC 的疾病相关状态，也可能受原始数据集注释和批次影响；尚无特异表面标志物或谱系证据。
4. 细胞通讯仍是推断：VDSC1–巨噬细胞和 COL6A2–CD44 未经空间、蛋白或阻断实验确认。
5. INHBA 机制链未闭合：没有直接检测 activin A 分泌、受体结合、SMAD2/3 激活，也缺少挽救实验。
6. 逻辑上有一定的断层：论文前半部分建立的是“VDSC1 细胞状态主线”，后半部分转向了“INHBA-VIC 成骨主线”，但中间缺少把二者连接起来的关键证据。此外，没有说明为何从21个候选基因中选择INHBA。
7. 体内证据较弱：小鼠每组 n=3，且只显示表达随模型变化，不能证明 INHBA 驱动病变。

数据公开与相关资源

单细胞数据

• GSE228638
• GSE213128
• PRJNA562645

bulk RNA-seq 数据

• GSE12644
• GSE51472
• GSE77287
• GSE83453
• GSE148219
• GSE235995