ATVB：空间与单细胞图谱揭示CAVD中VIC与巨噬细胞的性别差异

文献信息

题目： Spatial and Single-Cell Mapping Reveals Valvular Interstitial Cell and Macrophage Sex Differences in Calcific Aortic Valve Disease

作者： Talia Baddour, Van K. Ninh, Rayyan M. Gorashi, Rene Peña, Kevin R. King, Brian A. Aguado

期刊： Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology（2026;46:e324694）

DOI： 10.1161/ATVBAHA.126.324694

文章类型： 人体尸检瓣膜的横断面、多模态描述性研究

核心问题与一句话结论

核心问题

钙化性主动脉瓣疾病（calcific aortic valve disease, CAVD）中常见的“男性偏钙化、女性偏纤维化”表型，是否对应不同的瓣膜间质细胞（valvular interstitial cell, VIC）亚群、巨噬细胞亚群及其空间组织方式？

一句话结论

这项研究在人尸检瓣膜中描述了两个性别偏倚的组织轴：男性 CAVD 表现为较高钙化负荷、COMP 阳性细胞靠近钙化灶以及 VIC 中 AP-1 相关程序；女性 CAVD 表现为 SERPINE1 高表达 VIC、巨噬细胞患者间异质性和 CellChat 预测的 SPP1–CD44 通讯。

研究背景与作者假设

• CAVD 是主动脉瓣纤维化、增厚和钙化逐步累积的疾病。既往临床和组织学研究提示，男性瓣膜往往有更重的钙化，女性则可能在相似血流动力学严重度下表现出更多纤维化。
• 这种差异可能影响影像评估、疾病分期和未来的治疗靶点，但既往研究很少在同一组人组织中同时解析细胞状态和空间位置。
• 作者因此联合组织学、单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）、10x Visium 空间转录组、RNA-FISH 和免疫荧光，尝试从“组织表型—细胞亚群—空间定位—候选细胞通讯”建立一条性别差异证据链。
• 作者的工作假设是：男性与女性 CAVD 由不同的 VIC 和巨噬细胞程序驱动。

研究设计与样本

总体设计

• 人尸检主动脉瓣共 22 例：女性 10、男性 12。补充材料可还原为女性健康 3、女性 CAVD 7，男性健康 4、男性 CAVD 8。
• 按 Warren–Yong 组织学评分及钙化面积区分健康、硬化和狭窄阶段；组织学使用 Masson 三色染色、Alizarin red、von Kossa 和扫描电镜（SEM）。
• scRNA-seq 主图展示 13 位供体、74,713 个细胞：女性健康 1、女性 CAVD 4、男性健康 4、男性 CAVD 4。其中患者 24、25 来自既往公开数据。
• 空间转录组纳入 6 例 CAVD（女性 3、男性 3）：女性为 1 例硬化、2 例狭窄；男性为 2 例硬化、1 例狭窄。
• RNA-FISH 共 9 例；免疫荧光共 18 例。不同实验并非都使用同一批供体。

Warren–Yong 组织学评分

Warren–Yong scoring 是依据主动脉瓣增厚程度和钙化结节负荷进行的半定量组织形态学分级，并非超声心动图的主动脉瓣狭窄血流动力学分级。本文采用的定义为：

作者在主要分析中把 score 1 视为健康组织，把 score 2–4 纳入 CAVD；Supplementary Figures S7–S8 又将其合并为 1、2–3 和 4 三档。Figure 1C 另使用 healthy、sclerosis 和 stenosis 标签，但这些标签与 Warren–Yong 分数并非严格一一对应，因此不能直接把所有 score 3 自动等同为 sclerosis 或 stenosis。

本文主要结果

人主动脉瓣组织学分析显示瓣膜钙化和形态存在性别差异

• 男性 CAVD 的钙化面积为 22.6±15.0%，高于男性健康的 0.42±0.40%（P=0.0072），也高于女性 CAVD 的 7.9±3.8%（P=0.040）。女性 CAVD 与女性健康的钙化面积差异不显著（P=0.79）。
• 致密纤维面积在女性健康与 CAVD（P=0.99）、男性健康与 CAVD（P=0.86）及男女 CAVD（P=0.93）之间均无显著差异。
• 最大瓣膜厚度的三组比较同样均未显著：女性健康 vs CAVD P=0.089，男性健康 vs CAVD P=0.30，男女 CAVD P=0.37。
• 补充 Figure S9 显示，致密纤维面积与钙化面积在女性（R²=0.1972, P=0.1986）和男性（R²=0.0524, P=0.4740）中均无显著相关。
• 分期补充分析显示女性在硬化/狭窄阶段有增厚趋势；Figure S13 以厚度归一化后，男性 CAVD 的钙化面积/厚度比高于女性 CAVD（P=0.032）和男性健康（P=0.016）。

• SEM 的平均颗粒直径无性别差异：女性 537.3±34.1 nm，男性 463.7±165.5 nm，P=0.44。
• 男性粒径范围约为 379.4 nm，女性约为 82.6 nm。

单细胞 RNA 测序与空间转录组揭示驱动瓣膜纤维钙化的细胞异质性存在性别差异

• 13 位供体的 74,713 个细胞整合后在 UMAP 上总体混合。
• 作者把男女 CAVD 的 pseudobulk 差异基因与既往纤维化和钙化蛋白目录交叉。正文列举的男性交集包括 LGALS1、MIF、PLA2G2A、SERPINE2、S100A11、TIMP1、HLA-A、MYL6、IGFBP4；女性交集包括 ACTB、COL3A1、TAGLN2、CCL18、S100A10、FN1、C1QB、CST3、SPARC、HLA-DP1。

• 四类细胞的代表性 marker 为：
  • VIC：CLU、MGP、DCN、IGFBP7、PLA2G2A；
  • 巨噬细胞：HLA-DRB1、HLA-DRA、CD74、CXCL5、FTL；
  • VEC：SELE、IFI27、SERPINE1、CSF3、B2M、SERPINB1；
  • T 细胞：CD69、PTPRC、IL7R、SRGN 等。
• VIC 在全部组中占主导。作者将健康/CAVD 及不同性别之间四类细胞的总体组成描述为相似。
• Supplementary Figures S1–S3 说明各细胞群和亚群均来自多个供体，但不同供体贡献的细胞数及亚群比例差异很大。

将单细胞 RNA 测序细胞群评分映射至 CAVD 空间转录组组织

• 女性患者 23 为硬化期，患者 6、18 为狭窄期；男性患者 1、20 为硬化期，患者 29 为狭窄期。
• VIC score 在全部切片中广泛且整体最高。巨噬细胞、VEC 和 T 细胞 score 明显依赖具体患者，例如女性患者 6 的巨噬细胞和 VEC 信号较突出。
• panel B 的小提琴图使用每张切片的空间 spot（约 1,244–1,801 个）展示各细胞群评分分布。
• 补充 Table S10 显示空间测序质量差异很大：每个 spot 的中位基因数仅 44–428，中位 UMI 为 46–644；患者 23 尤其低（44 genes/46 UMI）。

VIC 亚群分析揭示男性 VIC 与转录因子 AP-1 相关

• VIC1：CDH19, KCNT2, LAMA2, FOS, APOE。
• VIC2：COL1A1, COL3A1, COMP, COL1A2, SPARC，富集胶原纤维、ECM 组织和 ossification，被作者称为 ECM-remodeling/osteoblast-like VIC。
• VIC3：PLA2G2A, CHI3L2, MT1X, CLU, SERPINA3, FGFBP2。
• VIC4：TIMP1, CCL19, DDIT4, HILPDA, SERPINE1，富集低氧/缺氧反应。
• VIC5：PTGDS, CFD, C7, FGF7, SFRP1, FBLN1，涉及趋化和骨重塑。
• VIC6：CCL2, SOD2, IRF, CXCL2, NFKBIA，呈炎症相关程序。
• VIC7：TAGLN, ACTA2, TPM2, ACTB, MYL9，富集 actomyosin、伤口愈合和收缩，被作者称为 activated myofibroblast。
• CAVD 中，女性 VIC4 比例为 13.2%、男性 3.2%（OR 4.412, P<0.0001）；女性 VIC5 为 4.85%、男性 10.6%（OR 0.4287, P<0.0001）；VIC7 为女性 3.01%、男性 2.32%（OR 1.308, P<0.0001）。
• 女性 VIC4 从健康 2.46% 增至 CAVD 13.2%（P<0.0001），男性则为 3.27%→3.32%（P=0.8421）。

• 男性多个 VIC 亚群高表达 FOS/JUN，作者将其概括为 AP-1 偏倚；COMP 也在男性 VIC2 中突出。
• IPA 预测女性偏倚的上游调控包括 NOTCH1、YAP1、SPP1、IL17F，男性偏倚候选包括 CMTM3、EPO。

• VIC2 score 在两性切片中均呈明显患者间异质性，女性患者 6 和男性患者 29 较高。
• VIC7 在女性患者 6、18 较高，作者据此描述为 2/3 女性切片中 VIC7 score 增加。

VIC2 标志基因 COMP 在男性组织钙化区域附近聚集

• COMP 在 3 个男性样本中的 2 个进入空间聚集前 5 marker：患者 1 Moran’s I=0.39、患者 20=0.35；患者 29 的前 5 中没有 COMP。
• COMP 与钙化 ROI 重叠的 OR：男性患者 1=4.66、20=10.33、29=2.67，均 P<0.0001；女性患者 23=1.475, P=0.0592，6=1.866, P<0.0001，18=0.686, P=0.0883。

• 供体层面的最短距离：男性 62.6±76.3 μm（n=5），女性 469.3±220.9 μm（n=4），Welch P=0.0059。
• 按距离分箱后，男性在靠近钙化的多个距离区间有更高的 COMP+ 细胞比例；最远区间差异不显著（P=0.155）。
• Supplementary Figure S21 显示，COMP+ nuclei 总比例为男性 9.2±4.5%、女性 5.8±6.4%，组间不显著（P=0.37）。

在 CAVD 组织中验证女性偏倚的 VIC 标志基因 SERPINE1

• 女性患者 6、18 同时有较高致密纤维面积和较高 SERPINE1+ spot 比例。男性样本整体较低，患者 20 仍可见一定信号。
• Supplementary Figure S24 显示 SERPINE1 与钙化 ROI 的重叠在 6 位空间供体中只有女性患者 6 达到显著（P=0.0481），其余 5 位均未显著。

• SERPINE1+ 细胞比例：女性 CAVD 3.7±1.7%（n=4），男性 0.5±0.40%（n=5），P=0.0286。
• SERPINE1+/SELE+ 双阳性比例极低且无性别差异：女性 0.014±0.019、男性 0.018±0.027，P=0.778。
• 作者据此认为，女性偏倚的 SERPINE1 表达主要由 VIC 而非 VEC 或 T 细胞贡献。

巨噬细胞分析揭示亚群功能及 SPP1–CD44 细胞通讯存在性别偏倚异质性

• 女性 CAVD 的 CD68+ 细胞均值约为男性的 2.2 倍；组间均值比较均未显著：女性健康 vs CAVD P=0.626，男性健康 vs CAVD P=0.984，男女 CAVD P=0.376。男女 CAVD 方差差异也未显著（Levene P=0.172）。
• 三个巨噬细胞亚群：
  • Mac1：CXCL8, NFKB1, HSPA1A, CCL3L1, HSP90AA1，偏 MHC II 抗原加工呈递；
  • Mac2：FTL, CSTB, CTSZ, FTH1, S100A10，偏细胞因子、TNF/应激程序；
  • Mac3：MGP, DCN, MT1X, C11orf96, IGFBP7，偏 ECM、软骨/骨发育和 ossification。
• 合并细胞比例显示，女性 CAVD Mac2 为 50.3%、男性 28.5%（OR 2.548, P<0.0001）；男性 CAVD Mac3 为 32.9%、女性 10.7%（OR 的方向按表中编码为 0.2447, P<0.0001）。
• 女性偏倚巨噬细胞基因包括 CXCL5, CCL18, FTH1, CSTB, S100A10, TXN；男性偏倚包括 NAMPT, NEAT1, FOS。女性 Mac3 中 SPP1、COL1A1 较突出。

• CellChat 在女性 CAVD 中预测 macrophage SPP1 向 VIC/T 细胞 CD44，以及向 ITGA9+ITGB1、ITGA5+ITGB1 等受体组合的通讯。
• Figure 7H 的女性 CAVD 分析包括 3 位供体，女性健康组包括 1 位供体。
• SPP1+/CD68+ 细胞均值：女性 CAVD 8.8±8.6%、男性 3.5±1.6%。女性健康 vs CAVD（P=0.558）、男性健康 vs CAVD（P=0.868）和男女 CAVD（P=0.187）均未显著；显著的是男女 CAVD 方差差异（Levene P=0.043）。
• CD44+ VIC 总体没有显著性别差异；VIC6 的女性柱较高。

• 女性：N=9, R²=0.083, P=0.45；男性：R²=0.2766, P=0.18。
• Supplementary Figure S30 显示 Mac2/Mac3 空间分布存在明显患者间差异。

作者的整体机制模型

男性轴

作者把男性较高钙化负荷、VIC 中 AP-1（FOS/JUN）偏倚，以及 COMP+ 细胞靠近钙化灶连接起来，并进一步推测：钙化颗粒/基质刚度可能通过 UTY、HDAC3 等表观遗传调控激活 COMP/AP-1，促进 VIC 的成骨样转分化。

女性轴

作者把女性 VIC4/SERPINE1、ECM/整合素相关富集、Mac2 及部分患者的 SPP1+ 巨噬细胞连接起来，并推测 SPP1–CD44 可能抑制钙化而与纤维化程序共存。

我的讨论

原文解释的强度

“COMP 调控男性钙化”“AP-1 是关键驱动”“SERPINE1 驱动女性纤维化”“SPP1–CD44 降低女性钙化”都比本文的直接证据更强。本文直接展示的是组织学差异、表达、空间关联和计算预测；没有对应的功能干预。

单细胞与空间转录组数据质量评估

单细胞数据：测序化学质量较好，供体间回收量和表达复杂度明显不均

• 作者本地完成 11 位供体的 scRNA-seq，并在最终 Figure 2 中加入 2 位公开健康供体，展示 13 位供体、74,713 个细胞。Supplementary Tables S5–S7 显示，本地文库的 valid barcodes 为 91.8%–97.6%，RNA read Q30 为 93.0%–96.7%，UMI Q30 为 97.0%–98.1%，说明碱基识别和 barcode/UMI 质量总体良好；confidently mapped to transcriptome 为 61.7%–83.4%，总体可用但存在供体差异。
• 每位本地供体的 Cell Ranger estimated cells 从 423 到 17,059，相差约 40 倍；median genes/cell 从 632 到 2,632，相差约 4.2 倍；median UMI/cell 从 1,136 到 8,651，相差约 7.6 倍。患者 10、15、22、23、27 的 median genes/cell 均低于 1,000，而患者 1 仅回收 423 个细胞，却达到 406,196 mean reads/cell 和 93.9% saturation，提示不同文库的细胞回收与分子复杂度很不均衡。
• 作者按 feature count <200 或 >7000 过滤，并对低 fraction reads 的样本使用 SoupX；但未报告线粒体转录本比例阈值、细胞活率、双细胞识别/去除方法、每位供体过滤前后的保留率，也未说明哪些样本实际运行了 SoupX。文中称每例计划捕获 2,000–5,000 个细胞，但多例 Cell Ranger estimated cells 超过 10,000；在未报告 doublet QC 的情况下，这一点难以充分核查。
• Figures S1–S3 显示主要细胞群及 VIC/巨噬细胞亚群在整合后由多个供体共同贡献，UTY 表达也支持性别标签；这是正面证据。不过，整合验证主要依赖 UMAP 的视觉混合，没有提供 LISI、kBET 等定量批次指标，各供体的细胞类型和亚群比例仍有明显差异。
• 分组结构存在重要限制：女性健康组只有公开数据中的患者 25 一位，女性健康与 CAVD 的比较因而同时混入“疾病状态、数据来源和单供体特征”。男性与女性 CAVD 比较均为本地供体，各 4 例，受这一特定来源混杂的影响较小，但生物学重复仍少。
• Methods 称本地 11 例与既往 N=5 数据整合后“总计 12 例”，Figure 2 和 Table S4 则明确为 11 位本地供体加患者 24、25 两位公开供体，共 13 例。该供体计数矛盾以及未提供逐供体 post-QC 细胞数，使 74,713 个最终细胞无法从补充表中完整复算。

空间转录组：输入 RNA 和测序读段质量良好，spot 级表达矩阵稀疏且切片间差异很大

• 6 张 Visium 切片均来自 CAVD 供体，RIN 为 7.2–8.6，达到作者设定的 RIN>7；valid barcodes 为 95.6%–97.4%，RNA read Q30 为 94.6%–97.3%，UMI Q30 为 96.6%–98.4%。从输入 RNA 和测序碱基质量看，这部分是合格的。
• 每张切片有 1,244–1,801 个 tissue spots，fraction reads in spots 为 67.9%–92.4%，mean reads/spot 为 44,899–240,952；sequencing saturation 已达 97.0%–99.8%。因此，这批数据并不是简单的“测序不够深”。
• 真正的问题在分子复杂度：confidently mapped to transcriptome 仅 23.0%–51.0%；median genes/spot 为 44–428，median UMI/spot 为 46–644，两者分别相差约 9.7 倍和 14 倍。患者 23 只有 44 genes/46 UMI per spot，患者 20 为 70/79，患者 29 为 89/106，患者 18 为 107/125；只有患者 1（428/644）和患者 6（306/413）相对丰富。高饱和度与低 genes/UMI 同时出现，说明继续增加 reads 很难补回已经缺失的分子，主要限制更像是组织捕获或文库复杂度，而非测序深度。

上表提取自table S10

• 技术质量并未简单地按性别单向分布：女性和男性组内都同时存在相对较好与较差的切片。但每性别只有 3 位供体，一张复杂度较高的切片就可能明显影响组别图形和差异分析。
• 作者用每个 scRNA 簇前 5 个 marker 构建 spot score。对于 median genes/spot 仅几十到一百左右的切片，五基因 score 会更容易受 dropout、测序复杂度和单个高表达基因影响；SCTransform/anchor integration 可以调整尺度和部分技术差异，却不能恢复未捕获的转录本。
• Figure 3 的小提琴图以每张切片上千个 spots 展示分布，Methods 也未描述供体随机效应或 donor-level spatial differential model。因此 spot 数不能替代 3+3 位供体的生物学重复。另有一个可复现性问题：Figure 3 图注称患者 20 有 1,264 个 spots，而 Table S10 报告 1,713 个。
• 空间数据的优势在于候选定位，而不是稳定估计全体男女 CAVD 的平均差异。作者随后用 RNA-FISH 在供体层面验证 COMP 距钙化灶的距离和 SERPINE1+ 细胞比例，这些原位验证显著提高了对应候选结果的可信度；没有独立原位验证的 marker score、Moran’s I 和 CellChat 结果仍更适合视为探索性发现。

综合判断

• scRNA-seq： 原始测序读段质量总体较好，主要细胞类型和性别标签可信；但供体间细胞回收与表达复杂度差异大，QC 和 pseudobulk/供体层面建模报告不足。适合建立候选细胞图谱，不足以仅凭 pooled-cell P 值确认稳定的性别差异。
• 空间转录组： 测序碱基质量和输入 RIN 良好，但表达矩阵整体偏稀疏、切片间异质性很大且只有 3+3 位供体。适合提出空间候选并指导 RNA-FISH 验证，不适合把 spot 级显著性直接解释为稳健的性别总体效应。

阅读这些结果时的方法学边界

1. 独立生物学重复是供体，不是细胞或空间 spot。 许多 VIC/巨噬细胞比例使用合并细胞的 Fisher 精确检验；Visium 小提琴图中的上千个点是技术观测，不会把 6 位供体变成上千个生物学重复。
2. Visium cell-type score 不是单细胞身份。 作者把各 scRNA 簇的前 5 个 marker 合并投射到 55 μm spot；一个 spot 可包含多个细胞，因此更适合解释为“某类细胞标志程序的局部强度”。
3. 通路和通讯多为预测。 IPA、EnrichR、Moran’s I 和 CellChat 提供候选调控关系或空间关联，不能替代蛋白活性、干预、阻断或挽救实验。

各组结果的证据边界

• Figure 1： 供体层面的组织学支持男性 CAVD 钙化面积更高；女性致密纤维总面积并未显著升高，男性钙颗粒“范围更宽”也没有正式推断检验。横断面比较不能说明男性钙化进展更快。
• Figure 2： UMAP 混合只能作为整合后的视觉检查，不能排除公开数据来源与性别、疾病状态耦合的混杂。转录本与既往蛋白目录的交集也不是同一批样本的蛋白验证。女性健康组只有 1 位供体，pseudobulk 的聚合单位、模型和协变量描述不足。
• Figure 3： 这些切片主要展示组织内和患者间异质性，并未进行正式的性别供体组比较。55 μm spot 是多细胞混合，spot 数不能替代 3 位女性与 3 位男性供体的生物学重复。
• Figure 4： 多个亚群比例的显著性来自合并细胞的 Fisher 检验，微小比例差可能因细胞数大而得到极小 P 值。GO、IPA 和 EnrichR 属于功能注释或调控预测；原文另报告女性 12.1%→12.0%、男性 15.9%→16.1%（后者 P<0.0001），却未注明这组比例对应的具体亚群。
• Figure 5： 供体层面的距离定量及 RNA-FISH 是较强的空间验证，支持男性 COMP+ 细胞更靠近钙化灶；COMP+ nuclei 总比例本身无显著性别差异，女性患者 6 的 COMP–钙化重叠也显著，因此不能扩展为“男性特异表达 COMP”或“COMP 驱动钙化”。
• Figure 6： SERPINE1+ 细胞的性别差异得到供体层面 RNA-FISH 支持，但 SERPINE1 与致密纤维只是平行展示，未做供体层面相关分析；其 VIC 归属也主要依赖 scRNA 表达和排除 SELE 共阳性，而非直接 VIC marker 共染。本文没有 PAI-1/VIC 功能干预。
• Figure 7： 女性 CAVD 的 CD68+ 和 SPP1+/CD68+ 细胞均值都未显著高于男性，显著差异主要见于合并细胞亚群比例或患者间方差。SPP1–CD44 是候选通讯，尚无分泌、结合、下游信号或阻断证据；VIC6 的 CD44 柱图没有 P 值或误差线，正文的 integrin 名称与图中 ITGA9/ITGA5+ITGB1 标注也不完全一致。

这篇文章真正完成了什么

1. 在同一研究框架内把人 CAVD 的组织学、scRNA、空间转录组和原位验证串联起来，提供了一张“性别相关细胞状态—空间位置”候选地图。
2. 将“表达量差异”与“空间位置差异”分开。COMP 总阳性率不显著，但男性 COMP+ 细胞距钙化灶更近，是非常值得保留的方法学启示。
3. 保留了患者间异质性：SERPINE1、巨噬细胞和空间亚群并非所有女性或所有男性一致改变，这比简单二分的性别故事更接近真实人组织。

最值得借鉴的方法

• 从组织学表型出发筛选空间候选，而不是只靠 scRNA 差异基因；再用连续切片和 RNA-FISH 把 spot 级关联提升到细胞/供体层面。
• 对空间候选同时比较“总阳性率”和“到病灶的距离”，避免把局部重定位误写成全组织表达升高。
• 将阳性结果与阴性结果一起解释：例如 COMP 总量不变、SERPINE1 多数样本不与钙化重叠、CD68 与钙化不相关，这些阴性信息实际上帮助界定各候选轴的性质。

关键局限

1. 女性健康供体只有 1 位。 女性健康—CAVD 的单细胞比较几乎不能用于一般化推断。
2. 统计单位存在伪重复风险。 亚群比例多用合并细胞 Fisher 检验，空间小提琴图用 spot；极小效应也可得到极小 P 值。更合适的验证应以供体为单位做差异丰度或混合效应模型。
3. 空间队列只有 3+3，且疾病阶段不平衡。 性别、疾病阶段和技术质量可能共同影响空间模式。
4. 空间数据技术异质性很大。 中位 genes/spot 从 44 到 428；cell-type score 又只基于前 5 个 marker，低复杂度样本的稳定性需要敏感性分析。
5. 外部数据整合描述不一致。 Methods、Figure 2 和补充表对供体数量的叙述互相矛盾，公开数据的来源构成也可能与分组耦合。
6. 多重比较与模型细节不足。 多个比例 Fisher 检验未清楚说明统一的多重校正；所谓 pseudobulk 的聚合单位、设计矩阵和协变量未充分报告。
7. 功效分析只覆盖超大效应。 作者以效应量 3.0 得出每性别 n=4，不能据此认为研究对中小效应也有充分把握。
8. 没有功能或纵向证据。 无 COMP、SERPINE1、AP-1 或 SPP1–CD44 的敲低/抑制、共培养、挽救、动物或疾病进展验证，也不能区分性染色体、激素环境和其他临床因素的贡献。

原文内部不一致

下一步最值得验证的问题

1. 用供体层面的差异丰度模型重新检验 VIC4/VIC5/VIC7、Mac2/Mac3 的性别差异，结论能否保留？
2. 在独立且按疾病阶段配平的队列中，COMP 到钙化灶的距离、SERPINE1+ VIC 和 SPP1+ macrophage 是否复现？
3. 操纵 COMP 是否改变 VIC 矿化；操纵 SERPINE1 是否改变胶原沉积/收缩；阻断 SPP1–CD44 是否改变 VIC 钙化与纤维化？
4. 这些差异来自性染色体、性激素、年龄/绝经状态，还是疾病阶段与合并症？
5. 更高分辨率空间技术或多重原位成像能否直接确认 SERPINE1+ VIC、SPP1+ macrophage 与 CD44+ VIC 的邻近和细胞身份？

总结

• 组织表型： 男性 CAVD 钙化面积更高；致密纤维面积和最大瓣膜厚度的性别比较均未达到显著。
• 男性相关结果： 男性 VIC 呈 AP-1/COMP 相关表达程序，且男性 COMP+ 细胞与钙化灶的平均距离更短。
• 女性相关结果： 女性 CAVD 组织的 SERPINE1+ 细胞比例更高；VIC 和巨噬细胞亚群呈性别偏倚转录特征。
• 细胞通讯： CellChat 在女性 CAVD 中预测了巨噬细胞 SPP1 与 VIC/T 细胞 CD44 等受体的通讯。