ATVB：主动脉瓣狭窄中的透明质酸结合蛋白聚糖重塑

英文题目：Aortic Stenosis Hyalectan Remodeling Revealed by Proteomics and Glycoproteomics

作者：Siqi Yin、Ursula Mayr、Javier Barallobre-Barreiro 等；通讯作者 Manuel Mayr。

期刊：Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology
PubMed PMID：42460473。

DOI：10.1161/ATVBAHA.126.323867

文章类型：原创转化研究；人瓣膜 ECM 蛋白质组与糖蛋白组、组织验证、体外 VIC 实验、小鼠遗传模型及公开小鼠单细胞数据再分析。

核心问题与一句话结论

核心问题：主动脉瓣狭窄中，能够与透明质酸结合的蛋白聚糖 hyalectans 如何重塑？这种重塑与 VIC 状态、瓣膜功能及炎症相关蛋白滞留有什么联系？

一句话结论：人 CAVD 瓣膜呈现从非钙化区相对富集 versican 向钙化区富集 aggrecan 的基质组成变化，ACAN/VCAN 比值与跨瓣压差正相关；在高胆固醇背景下，ADAMTS5 催化活性缺失伴随 hyalectan 积聚、瓣叶增厚和瓣膜功能障碍，同时出现 HA 相关的 PTX3 滞留。

Graphical Abstract

下图概括本文的三个研究层次：人瓣膜的区域性基质组成差异、HA 相关的 PTX3 滞留，以及 ADAMTS5 催化活性缺失小鼠的基质与瓣膜功能表型。

Graphical Abstract（A–C）：主动脉瓣狭窄中的基质蛋白聚糖重塑。本图根据 Yin 等（ATVB，2026）的研究内容，使用 ChatGPT 生成，由用户提供。A：同一重度 AS 瓣膜内非钙化区与钙化区的 VCAN/ACAN 组成差异及相关 VIC 状态；B：ITIH 相关复合物中的 PTX3 滞留模型，以及离体切片经透明质酸酶处理后 HA、PTX3 染色降低；C：高胆固醇背景下 ADAMTS5 活性缺失小鼠的蛋白聚糖积聚、瓣叶增厚、脂质沉积及功能障碍，实线箭头表示观察到的干预效应，虚线表示推测的分子关联。

引言

疾病背景与切入点

作者将钙化性主动脉瓣疾病（calcific aortic valve disease，CAVD）视为主动发生的组织重塑过程。除了钙盐沉积，瓣膜中的胶原、蛋白聚糖及其降解产物也发生改变。本文关注的不是单一成骨基因，而是承载细胞、保持水合并参与脂质滞留的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）。

蛋白聚糖由核心蛋白及其糖胺聚糖链组成。小分子富亮氨酸蛋白聚糖（SLRPs）参与胶原组织化；hyalectans 则是体积较大的聚集性蛋白聚糖，能够结合透明质酸，通过糖链和水合性质参与组织抗压与润滑。Versican 是正常血管和瓣膜中重要的 hyalectan，aggrecan 则具有鲜明的软骨基质背景。

已有线索与研究空白

ADAMTS 家族蛋白酶能够切割 versican 和 aggrecan。既往研究提示，ADAMTS5 催化活性缺失可以引起瓣膜 versican 积聚、黏液样改变；在人 VIC 中沉默 ADAMTS5 也与成骨样转变有关。与此同时，遗传及转录组关联研究将 ACAN 指向主动脉瓣狭窄风险。

这些线索尚未回答：在人病变瓣膜中，哪些 hyalectan、哪些蛋白片段和糖肽实际发生变化？这些变化是否具有区域性，又是否能与瓣膜功能联系起来？常规细胞裂解液不易提取体积大、难溶并紧密嵌入 ECM 的蛋白，因此需要针对 ECM 的提取流程。

作者的研究目标

作者先在人瓣膜中建立 ECM 蛋白与糖肽的组成图谱，再用靶向质谱、组织染色和细胞实验解释 VCAN/ACAN 的差异分布；随后在 Adamts5 催化活性缺失与 ApoE 缺失共同存在的小鼠中观察瓣膜功能与基质变化，并进一步分析 PTX3 如何在 HA 相关基质中积聚。

关键术语与方法背景

术语	在本文中的含义与作用
Hyalectan	透明质酸结合的聚集性蛋白聚糖家族；本文重点为 VCAN 与 ACAN。不要与 HA 本身混为一物。
Versican / VCAN	多功能蛋白聚糖；本文将其与非钙化区、Postn⁺ 激活 VIC 及临时性基质联系起来。V1 是本文关注的主要剪接异构体。
Aggrecan / ACAN	聚集蛋白聚糖；本文在钙化区和 Spp1⁺ VIC 中发现其富集。
HA / hyaluronan	透明质酸，无核心蛋白的糖胺聚糖。蛋白质组不能直接测量 HA，文中通过 HABP 结合染色等方法检测。
HAPLN1	Hyaluronan and proteoglycan link protein 1，连接 HA 与蛋白聚糖的基质连接蛋白。
ADAMTS5 / Adamts5Δcat	蛋白聚糖酶及其催化结构域缺失模型；Δcat 指催化活性缺失，不能简单理解成所有 ADAMTS5 蛋白结构均被删除。
Neoepitope	蛋白被特定位点切割后产生的新表位，用于检测切割产物。本文使用 VCAN-DPEAAE、ACAN-NITEGE/NVTEGE 抗体。
NaCl 与 GuHCl 组分	先用 0.5 M NaCl 提取 1 h，获得可溶性 ECM、片段和大量细胞蛋白；再用 4 M 盐酸胍提取 48 h，获得较难溶的核心基质。
糖蛋白组 / glycoform	检测带糖肽段的位点与糖组成形式；本文完整糖肽流程与去糖后的常规蛋白质组流程分开。
TMTpro / HCD-alt-EThcD	TMTpro 支持样本多重定量；交替碎裂结合肽段、糖链和位点信息，HCD 报告离子用于定量。
PRM	Parallel reaction monitoring，平行反应监测；针对预先选定的蛋白特征肽进行靶向验证。
aVIC / oVIC	激活、肌成纤维样 VIC / 成骨样 VIC；本文结合标志物与培养条件描述这些状态。
PTX3 / ITIH	Pentraxin 3，正五聚蛋白 3；inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chains，间α胰蛋白酶抑制剂重链。作者将 PTX3 的 HA 相关滞留与 ITIH 联系起来。
AS / AR / DKO	主动脉瓣狭窄 / 主动脉瓣反流 / 文中 Adamts5Δcat/ApoE−/− 双缺陷小鼠的简称。

本文的主要研究结果

整体路线是：人瓣膜分区与两步 ECM 提取 → 蛋白质组和糖蛋白组发现 → 靶向质谱及组织定位 → VIC 状态与表达 → 小鼠功能表型 → HA–ITIH–PTX3 相关基质滞留。

1. 分步提取揭示人瓣膜可溶性与核心基质的不同重塑特征

人组织总队列包含 46 位患者：29 位接受心脏移植的心衰患者提供无钙化、无狭窄、无反流的对照瓣膜；17 位因严重 AS 接受换瓣手术的患者提供病变瓣膜。后者分别取同一瓣叶的肉眼非钙化区与钙化结节中心，因此产生 29＋17＋17＝63 个组织样本，经两步提取后得到 126 份蛋白提取物（Figure 1A；补充方法 Human Sample Collection）。

对照来自 Budapest，CAVD 来自 Edinburgh；样本均新鲜冷冻。Table S2 中，对照与 CAVD 的年龄分别为 55（32–66）岁和 71（57–84）岁，男性比例为 72.4% 与 64.7%，BMI 为 27.4±0.9 与 30.87±1.4 kg/m²，NYHA III–IV 比例为 86.2% 与 35.3%。年龄、BMI 和心衰严重程度存在组间差异。年龄括号形式依 Table S2 表注为四分位间距；相关记录口径见“我的讨论（AI enhanced）”。

提取验证显示：完整 VCAN、ACAN 和 decorin 主要在 GuHCl 组分；ACAN 的 ADAMTS 切割片段 NITEGE392 主要在 NaCl 组分。GAPDH、vimentin 也主要进入 NaCl 组分（Figure 1B）。

Figure 1A–C. 人瓣膜分区取样与两步基质提取。 A：对照瓣膜及病变瓣膜的非钙化区、钙化区取样；B：Western blot 比较 NaCl 与 GuHCl 组分中的完整蛋白及切割片段；C：两种组分的差异蛋白环形热图，外环比较病变非钙化区与对照，内环比较同一病变瓣膜的钙化区与非钙化区。

发现型质谱持续定量到 350 个可溶性基质蛋白与 372 个核心基质蛋白。PCA 中，NaCl 组分更明显地区分对照与病变非钙化区；GuHCl 组分更明显地区分病变内的非钙化与钙化区（Figure S1B–C；Tables S3–S4）。

Figure S1. 基质蛋白质组流程与组分差异。 A：分步提取、去糖基化和发现型质谱流程；B、C：分别展示 NaCl、GuHCl 组分的 PCA，以及非钙化区相对对照的上调蛋白、钙化区相对非钙化区的下调蛋白所富集的功能。

可溶性组分中，非钙化区相对对照上调的蛋白富集于补体/凝血（q＝1.89×10⁻¹⁷）、细胞黏附（q＝5.68×10⁻¹²）与 ECM 抗压相关蛋白聚糖（q＝1.37×10⁻¹¹）。核心基质中，钙化区相对非钙化区的上调蛋白富集于补体/凝血（q＝9.30×10⁻⁴³）及蛋白水解相关过程（q＝5.70×10⁻¹⁴），下调蛋白中 ECM 抗压相关条目突出（q＝3.28×10⁻²⁰）。NaCl 非钙化区相对对照的下调蛋白未产生显著富集通路（Figure 1C；Figures S1–S2）。

**统计与定量方法：**蛋白鉴定使用 1% FDR，至少 2 条唯一肽；总离子强度归一化。人 CAVD 与对照比较采用 limma/eBayes 并校正年龄、性别；同一病变瓣膜内使用配对 t 检验，差异检验进行 BH 校正。主图主要采用调整后 P＜0.05 与约 1.5 倍变化阈值。蛋白缺失率一般要求＜30%，剩余缺失用 KNN（k＝3）填补；一种表型＞90% 缺失而另一表型＜10% 缺失时采用零值填补（Methods；Figure 1 图注；Tables S3–S4）。

2. 糖蛋白组显示钙化区形成 Aggrecan 富集的蛋白聚糖组成

糖蛋白组使用 GuHCl 提取物，每样本 35 μg 蛋白，经消化、TMTpro 16plex 标记、ZIC-HILIC 糖肽富集及 Orbitrap Ascend 分析。这一子集是 15 个对照＋15 个非钙化区＋15 个配对钙化区，共 45 个组织样本；样本数以 Table S5 表注及 PXD078618 的样本处理记录 为依据。共做 3 批 TMT，使用混合参考样本，每批分为 16 个色谱组分；色谱组分数与生物样本数分别计数。

作者报告 3,229 条独特糖肽、274 个糖蛋白，约四分之一糖肽来自蛋白聚糖。针对含典型 N-糖基化基序的糖肽，正文报告 12 种蛋白聚糖、141 种显著变化 N-glycoforms，分成 4 个具有不同区域特征的簇；展示中也纳入连接蛋白 HAPLN1（Figure 2A–B；Tables S5–S6；条目核对见“我的讨论（AI enhanced）”）。

糖肽簇	原文报告的分布特征
Cluster 1	钙化区富集，突出 ACAN 相关糖肽。
Cluster 2	病变非钙化区富集，含多种 SLRPs。
Cluster 3	对照较高、病变下降，涉及 HSPG2/perlecan、biglycan 等基质组织化相关成分。
Cluster 4	钙化区明显减少，包含 VCAN、HAPLN1 及多种 SLRPs。

Figure 2B 标出了 ACAN-N126/N333、VCAN-N330、HAPLN1-N56 等位点。不同位点/糖组成的行形成不同热图模式，作者将其解释为 versican-rich ECM 向 aggrecan-enriched ECM 的组成变化。

Figure 2A–C. 糖肽组成与人瓣膜区域性表达。 A：糖肽富集和质谱分析流程；B：对照、病变非钙化区及钙化区的糖肽热图，标出四个变化簇；C：ACAN、VCAN V1 和 HAPLN1 的组织 qPCR，HAPLN1 转录未显著改变。

qPCR 显示，钙化区 ACAN 高于对照；VCAN V1 在病变组织中较对照降低，非钙化区均值高于钙化区；HAPLN1 转录水平无显著变化。作者在 Results 中强调 VCAN 与 ACAN 的区域分布不同，并指出 HAPLN1 蛋白下降与转录不变并存（Figure 2C）。

补充结果显示，非钙化区 ADAMTS1、ADAMTS5 转录降低。与此同时，NaCl 组分中的 VCAN-DPEAAE 切割片段更偏向非钙化区，ACAN-NITEGE 片段更偏向钙化区。作者解释，切割片段水平受到可供切割的底物数量影响，因而转录下降仍可与切割片段存在并存（Figure S3A–B）。

3. ACAN/VCAN 比值与跨瓣压差正相关，组织染色支持区域性分布

作者建立 PRM 靶向方法，正文与补充方法报告检测 118 个 ECM 蛋白、210 条肽段。相对于发现型质谱，非钙化区/对照的变化相关系数为 Spearman ρ＝0.91，钙化区/非钙化区为 ρ＝0.95，均 P＜0.001（Figure S3C–D；Table S7）。

Figure S3. ADAMTS 表达、底物切割及靶向质谱验证。 A、B：人瓣膜 ADAMTS 转录水平，以及 VCAN、ACAN 完整蛋白和切割片段；C、D：PRM 流程及其与发现型质谱的变化相关性，两组比较的 Spearman ρ 分别为 0.91 和 0.95。

**关键蛋白的定量结果如下。**表中直接摘录作者的 log₂FC 与 BH-FDR，不由展示均值重新计算；NC＝CAVD 非钙化区，C＝同瓣膜钙化区（Tables S3–S4）。

蛋白与组分	NC / 对照：log₂FC；FDR	C / NC：log₂FC；FDR
VCAN，NaCl	＋0.991；0.00425	−0.848；0.0145
VCAN，GuHCl	−0.404；0.181	−1.427；1.02×10⁻⁵
ACAN，NaCl	＋1.586；0.000474	＋0.988；0.0181
ACAN，GuHCl	＋0.655；0.468	＋1.576；0.0220
HAPLN1，GuHCl	−0.357；0.271	−1.022；0.00304

以经过缩放的蛋白丰度计算 ACAN/VCAN 比值，钙化区高于非钙化区和对照。在病变瓣膜中，使用钙化区蛋白数据并调整年龄与 BAV 状态后，ACAN/VCAN 比值与跨瓣压差呈显著正关联；ACAN 或 VCAN 单独水平的关联均不显著（Figure 3A–B）。

Figure 3A–B. ACAN/VCAN 比值及其与跨瓣压差的关系。 A：柱图为缩放蛋白丰度所得的比值，旁侧由纤维化指向矿化的曲线为作者的解释模型；B：回归分析横轴为 β 系数、纵轴为 −log₁₀(P)，ACAN/VCAN 比值与跨瓣压差呈正关联。

组织免疫过氧化物酶染色中，VCAN 位于对照瓣叶的海绵层，在病变非钙化区域染色增强；ACAN 在钙化区域染色更明显，与蛋白质组的区域差异相符（Figure 3C）。

Figure 3C. ACAN 与 VCAN 在人瓣膜中的组织分布。 免疫染色对比对照、病变非钙化区和钙化区，并展示局部放大及阴性对照；VCAN 在非钙化区染色较明显，ACAN 在钙化区染色较明显。

PRM 还分别报告 ACAN、VCAN 的 N 端与 C 端肽段。钙化区/非钙化区比较中，ACAN C 端为 log₂FC＝＋1.596、FDR＝0.0120，N 端为＋0.785、FDR＝0.155；VCAN N 端与 C 端则均显著下降（Table S7）。

4. VIC 状态与 Hyalectan 表达呈现不同对应关系

人瓣膜 NaCl 蛋白质组中，病变组织出现 aVIC 标志物 TAGLN、ACTA2、POSTN 及 oVIC 相关蛋白 CTHRC1、SPP1、COMP、SPARC 的增加；CD14、CD163、MAC2 等炎症相关蛋白及 PTX3 也升高。Western blot 验证了选定蛋白的变化（Figure 4A–B；Figure S4B）。

Figure 4A–B. 人瓣膜细胞状态相关蛋白的变化。 A：NaCl 提取物中 VIC、激活及成骨相关 VIC、炎症相关蛋白的热图；B：Western blot 展示 VIM、ACTA2、COMP、PTX3 和 ITIH1 在三类组织中的信号。

**PTX3 的变化有提取组分差异。**NaCl 组分中，NC/对照为 log₂FC＝＋1.300、FDR＝0.0158，C/对照为＋1.691、FDR＝0.000780；但 C/NC 不显著（FDR＝0.859）。GuHCl 组分中，C/NC 反而降低（log₂FC＝−1.685、FDR＝0.00409）；NC/对照仅名义 P＝0.0283，FDR＝0.0849，C/对照也不显著。GuHCl 靶向 PRM 同样显示 C/NC 的 PTX3 下降（log₂FC＝−1.060、FDR＝0.000281）。人组织 PTX3 转录未显著改变（Tables S3–S4、S7；Figure S4C）。

人 VIC 购自 Innoprot 和 Lonza，实验使用 P4–P6。作者比较对照、TGFβ1、成骨和成软骨培养条件，qPCR 取第 3、7、14 天（Figure 4C；补充方法 Cell Culture）。

条件	关键成分	主要表达结果
对照	DMEM＋5% FBS	提供同时点参照。
TGFβ1	10 ng/mL TGFβ1	第 7 天 VCAN 上升，并伴 POSTN 增加。
成骨	50 μg/mL 抗坏血酸、100 nM 地塞米松、10 mM β-甘油磷酸	SPP1 反应较晚，第 14 天升高。
成软骨	500 ng/mL BMP2、10 ng/mL TGFβ1，另含丙酮酸钠、抗坏血酸-2-磷酸、ITS、白蛋白	第 14 天 ACAN 明显上调，SPP1 也明显升高。

作者再分析公开小鼠主动脉瓣 scRNA-seq 数据 GSE180278，来源包含 WT、ApoE−/−、Ldlr−/−。Vcan 与 Postn⁺ VIC 的分布较一致，Acan 则富集于 Spp1⁺ VIC；Acan⁺ 细胞主要来自高胆固醇小鼠。Spp1⁺ VIC 还表现出 Comp、Hapln1、Adamts5 等表达特征。Mouse AV 的 Vcan V1 为主要异构体，V2 在 qPCR 中未检测到（Figure 4D；Figure S5A–C）。

Figure 4C–D. 培养条件与 VIC 表达状态的对应关系。 C：人 VIC 在对照、TGFβ1、成骨及成软骨条件下，第 3、7、14 天的 VCAN、POSTN、ACAN、SPP1 表达；D：小鼠瓣膜单细胞 UMAP 显示 Vcan/Postn 与 Acan/Spp1 的不同表达分布。

Figure S4D 展示成骨、成软骨培养的茜素红染色及 TGFβ1 条件下的细胞骨架变化；Figure S4E 补充 COMP、SPARC、CNN1、TAGLN。图示时间与方法文字有差异，列于“我的讨论（AI enhanced）”。作者将这些结果解释为不同刺激和时间下 VCAN/ACAN 表达的差异调节（Figure 4C；Figure S4D–E）。

Figure S4. 细胞标志物、组织验证与人 VIC 培养表型。 A–C：瓣膜细胞标志物示意、Western blot 定量和组织 qPCR；D、E：培养细胞的茜素红及细胞骨架染色，并补充 COMP、SPARC、CNN1、TAGLN 的表达时间变化。

CellChat 推断 Spp1⁺ VIC 是 SPP1 信号的重要发送群体，预测受体配对包括 CD44 及整合素复合物（Figure S5D）。本文直接使用原作者预处理、归一化后的表达矩阵；CellChat 使用 mouse 数据库，过滤少于 10 个细胞的相互作用。

Figure S5. Hyalectan 表达、单细胞来源与 SPP1 通讯预测。 A–C：人鼠瓣膜 VCAN 异构体与 ACAN 表达、不同小鼠来源的细胞分布及 VIC 亚群标志物；D：CellChat 推断的 SPP1 网络与配体–受体贡献，包含 CD44 和整合素相关配对。

5. ADAMTS5 活性缺失与高胆固醇背景共同伴随瓣膜功能障碍

Adamts5Δcat 小鼠缺少 ADAMTS5 催化结构域，瓣膜中的 ACAN-NVTEGE373 和 VCAN-DPEAAE441 片段减少。作者将其与 ApoE−/− 杂交，比较 WT、Adamts5Δcat、ApoE−/−、Adamts5Δcat/ApoE−/− 四组（Figure 5A）。

约 10% Adamts5Δcat 及双缺陷小鼠有二叶式主动脉瓣。作者在终末取材检查瓣膜形态，后续主要分析排除 BAV，聚焦三叶瓣小鼠（Figure 5B；Figure S6A；补充方法）。

Figure 5A–B. ADAMTS5 催化活性缺失后的底物切割与瓣膜形态。 A：小鼠瓣膜 Western blot 显示 ACAN、VCAN 切割片段减少；B：Adamts5Δcat 及其与 ApoE 缺失组合的小鼠中，三叶瓣与二叶瓣的代表性形态。

超声观察显示，双缺陷小鼠的主动脉瓣开放间距减少、跨瓣流速升高；彩色多普勒用于区分 AS 与 AR。下列数值来自 Tables S8–S9，均为均值±SEM；“峰值流速”沿用补充表的指标名称。

雄性小鼠终点	12 周 WT（n＝10）	12 周 ApoE−/−（n＝12）	12 周双缺陷（n＝17）	52 周 WT（n＝8）	52 周 ApoE−/−（n＝7）	52 周双缺陷（n＝8）
瓣尖开放间距，mm	1.27±0.02	1.24±0.02	1.08±0.04	1.26±0.02	1.19±0.03	0.90±0.08
峰值流速，mm/s	1007.17±37.21	875.86±34.94	1702.36±231.84	774.31±38.87	1067.82±105.30	2024.74±243.29
峰值压差，mmHg	4.12±0.31	3.13±0.24	15.25±3.74	3.24±0.52	5.08±0.84	18.30±4.69
射血分数，%	55.13±1.29	55.08±1.11	51.05±1.64	59.35±1.61	57.31±2.41	41.88±4.29

Table S8 中，12 周双缺陷组相对 WT 的开放间距 P＜0.01、峰值流速及峰值压差 P＜0.05；Table S9 中，52 周开放间距、峰值流速分别标记为 ***，峰值压差和射血分数为 **。表注定义 ** 为 P＜0.01，但未单独解释 ***。表中星号比较对象是 WT；四组间比较见 Figure S6C–D。

Figure 5C–D. 四种基因型小鼠的代表性超声。 C：瓣尖开放间距；D：跨瓣血流速度波形。图内数值对应所展示个体，各组统计见正文表格与 Figure S6。

Figure 5E 展示 Normal、AR、AS、AR＋AS 的构成。52 周双缺陷雄鼠全部出现瓣膜病变，雌鼠为 40%；这些百分比描述该图的瓣膜功能异常构成。52 周双缺陷小鼠出现更明显的瓣叶增厚和瓣尖内脂质沉积，并伴心室肥厚；12 周时心室重量尚无显著差异（Figure 5E–F；Figure S6C–E）。

Figure 5E–F. 瓣膜功能异常构成与脂质沉积。 E：12 周雄鼠、52 周雄鼠和雌鼠中正常、反流、狭窄及二者并存的比例；F：52 周各基因型瓣膜的油红 O 染色与局部放大，展示瓣叶形态及脂质分布。

与 ApoE−/− 相比，双缺陷小鼠的总胆固醇同样升高，组间无显著差异，体重也无显著差异。雌鼠的基质与功能变化总体较弱（Figure S6F–G；Tables S8–S9）。

Figure S6. 小鼠瓣膜功能、结构与全身指标的补充定量。 A、B：二叶瓣比例及正常、反流、狭窄的彩色多普勒示例；C–E：不同年龄的开放间距、流速、心室重量及瓣叶厚度和脂质染色；F、G：血胆固醇和体重。

进一步的饮食实验按照 Figure S7A 从约 6 周开始，给予普通饮食或 Western diet 12 周，约 18 周评价。Western diet 含 34.2% 脂肪热量比例和 0.25% 胆固醇。双缺陷小鼠在 Western diet 后开放间距减小，ApoE−/− 相应组未出现同样变化；图中同时展示双缺陷瓣尖更明显的脂质沉积。饮食实验另有独立的胆固醇和体重统计（Figure S7）。

Figure S7. 普通饮食与 Western diet 下的瓣膜变化。 A、B：ApoE−/− 与双缺陷小鼠的饮食设计、胆固醇和体重；C、D：饮食前后瓣尖开放间距及终点油红 O 染色，展示基因型与饮食组合下的功能和脂质变化。

6. 小鼠瓣膜中 Hyalectan、HA 相关蛋白与 PTX3 积聚

核心基质质谱比较 12 周雄性 ApoE−/− 与双缺陷小鼠各 n＝8，以及 52 周雄鼠各 n＝4。Figure 6A 的横、纵轴分别是 12 周和 52 周的基因型间 log₂FC；红点表示两个时间点方向一致，且至少一个时间点显著。全图 Spearman ρ＝0.27，P＜0.001。作者总体报告定量到 239 个 ECM 及相关蛋白（Figure 6A；Tables S10–S11）。

双缺陷雄鼠的 VCAN、ACAN、PTX3 及部分 HA 相关蛋白增加。选定结果如下；小鼠补充表提供的是未校正 P 值。

蛋白	12 周双缺陷 / ApoE−/−：log₂FC；P	52 周雄性双缺陷 / ApoE−/−：log₂FC；P
VCAN	＋0.924；0.00636	＋0.564；0.0352
ACAN	＋0.727；0.0312	＋0.534；0.0313
PTX3	＋2.001；1.18×10⁻⁶	＋2.711；0.000248
HAPLN1	＋0.833；0.000664	＋0.195；0.571
ITIH2	＋1.804；2.37×10⁻⁶	＋1.573；0.00800

Western blot 显示双缺陷组 VCAN 切割产物减少、HAPLN1 和 PTX3 增加。12 周组织 Has1、Has2 转录增加；Hyal1、Hyal2、Hyal3、Cd44 无显著差异。Adamts4 转录升高，Adamts1 未代偿升高；作者认为 Adamts4 的变化仍未恢复 hyalectan 切割（Figure 6B–C；Figure S8B–C）。

Figure 6A–C. 小鼠基质蛋白变化与透明质酸合成相关表达。 A：12 周与 52 周双缺陷相对 ApoE−/− 的蛋白 log₂FC 对照，红点为方向一致且至少一个年龄显著的蛋白；B：VCAN 切割片段、HAPLN1 和 PTX3 的 Western blot；C：12 周瓣膜 Has1、Has2 的 qPCR。

52 周雌性蛋白质组每组 n＝3。PTX3 增加仍显著（log₂FC＝＋2.913，P＝0.00112），但 ACAN（P＝0.174）和 VCAN（P＝0.890）均不显著，HA 相关基质改变较雄性弱（Figure S8A；Table S11）。

双缺陷瓣膜组织的 Tgfb1、Spp1、Comp 转录上升，Ptx3 转录未显著改变。为观察没有 ApoE 缺失背景时的细胞表现，作者培养 WT 与 Adamts5Δcat VIC：缺失 ADAMTS5 活性的 VIC 条件培养液中完整 VCAN 增加、VCAN 切割减少，同时 Tgfb1、Spp1 上调，Comp 和 Ptx3 未显示同样的显著上调（Figure S8D–E）。细胞由同基因型 2–3 只小鼠瓣叶混合分离，实验使用 P8–P12（补充方法 Murine VICs）。

Figure S8. 性别分层的基质变化及组织、细胞验证。 A：52 周雄鼠与雌鼠的差异蛋白火山图；B–D：瓣膜 HA 相关基因、ADAMTS 及表型相关转录；E：WT 与 Adamts5Δcat 原代 VIC 的 qPCR，以及培养液中完整 VCAN 和切割片段。

7. 透明质酸酶处理与免疫沉淀支持 PTX3 在 HA 相关基质中的滞留

52 周 ApoE−/− 小鼠的 MAC2⁺ 细胞主要见于主动脉根部粥样病灶；双缺陷小鼠则在瓣尖的富脂区域也能见到 MAC2⁺ 细胞。作者未定量主动脉根部粥样斑块总负荷，分析集中于瓣膜病变（Figure S9A）。

对小鼠组织切片进行 40 U/mL 透明质酸酶、37°C、1 h 处理后，HA/HABP 染色明显减弱，PTX3 信号也减少，MAC2 染色未受同样影响。作者将其解释为 PTX3 积聚至少包含一个依赖 HA 基质的部分（Figure 6D；Figure S9B）。

在人瓣膜 NaCl 提取物中，PTX3 与 ITIH1、ITIH2、ITIH3 呈显著正相关。进一步以 ITIH1 抗体对人对照和病变非钙化瓣膜的 混合蛋白提取物 做免疫沉淀：HA 与 PTX3 可随 ITIH1 共同沉淀，沉淀后的上清中对应信号减少。每次实验使用 100 μg 混合提取蛋白、10 ng ITIH1 抗体，设 rabbit IgG 对照（Figure 6E–F；补充方法 Immunoprecipitation）。

Figure 6D–F. PTX3 与 HA 相关基质的联系。 D：双缺陷小鼠切片经透明质酸酶处理后，HABP 和 PTX3 信号降低，MAC2 未见同样变化；E：人瓣膜 NaCl 组分中 PTX3 与 ITIH 蛋白的相关性；F：人组织混合提取物的 ITIH1 免疫沉淀及上清，检测 HA、ITIH1、PTX3。

非还原 Western blot 补充展示 PTX3 多聚体相关信号；Figure S9D 图注及原始 WB 将其标记为免疫沉淀后的 supernatant。人瓣膜组织染色中，PTX3 在对照主要位于内皮下，在病变瓣膜 ECM 破坏及早期钙化附近富集（Figure S9D–E）。

血浆 ELISA 显示：**12 周各基因型间 PTX3 无显著差异；52 周双缺陷组高于 WT，但与 ApoE−/− 组无显著差异。**作者据此分别讨论局部组织滞留与循环 PTX3（Figure S9C）。

Figure S9. 局部炎症、循环 PTX3 与人瓣膜组织定位。 A、B：小鼠瓣膜 HA/MAC2 分布及切片酶处理定量；C：血浆 PTX3，12 周组间无显著差异，52 周双缺陷高于 WT、与 ApoE−/− 无显著差异；D、E：免疫沉淀后上清中的 PTX3 多聚体及人瓣膜 PTX3/HABP 染色。

8. 人队列排除二叶瓣后的差异模式保持一致

17 位人 CAVD 患者中有 2 位为 BAV。排除这两位后，NaCl、GuHCl 组分中“非钙化区/对照”和“钙化区/非钙化区”的蛋白变化，与全队列高度相关。Figure S10 图内显示 Spearman 相关系数约 0.98，图注写 R＞0.98。作者据此认为少量 BAV 病例未明显改变总体差异模式（Figure S10）。

结论（要点归纳）

1. 两步提取揭示可溶性与核心 ECM 的不同变化，并提高大分子蛋白聚糖的检测能力。
2. 人病变瓣膜的 VCAN 与 ACAN 具有区域性差异，钙化区 ACAN/VCAN 比值升高，并与跨瓣压差正相关。
3. 人 VIC 培养和公开小鼠单细胞再分析显示，VCAN 更偏向激活/肌成纤维样状态，ACAN 更偏向成软骨条件及 Spp1⁺ 状态。
4. Adamts5Δcat 与 ApoE 缺失共同存在时，小鼠出现 hyalectan 积聚、瓣叶增厚、脂质沉积及功能障碍；表现具有年龄和性别差异。
5. 切片酶处理和 ITIH1 免疫沉淀支持 PTX3 在 HA 相关基质中的滞留，PTX3 蛋白与转录、局部组织与循环测量并不总是同步。

原文讨论

作者强调的贡献与解释模型

作者认为，针对 ECM 的强提取条件，结合非靶向、靶向和完整糖肽质谱，使本文成为较全面的人 CAVD 基质蛋白分析。VCAN 向 ACAN 的组成偏移，被作者类比为软骨发育及软骨内成骨之前的基质转换：VCAN 丰富的暂时性基质与细胞活化、迁移相关，ACAN 与 COMP 的积聚更接近软骨样基质成熟。

作者进一步提出分阶段模型：早期 VCAN/HA 丰富的基质支持 PTX3 滞留和炎症相关重塑；之后 ACAN 在 Spp1⁺ VIC 中表达、与 COMP 的区域富集相伴。作者在讨论中明确说明，PTX3 并非直接结合 HA，而是通过 ITIH 重链相关相互作用进入 HA-rich matrix。这用于解释 PTX3 蛋白增加而局部转录不相应升高。

作者承认的局限

双缺陷模型未完整重现人类 CAVD 的晚期钙化；ADAMTS5 虽偏好 hyalectan，仍可能影响其他底物。小鼠主分析限于三叶瓣，BAV 数量不足以形成有意义的亚组。人队列规模及性别构成不足以可靠分析性别效应。

作者提出的未来方向

作者提出研究 hyalectan 与 HA 相关干预，以减轻进行性的蛋白聚糖积聚，并讨论阻断糖胺聚糖与 LDL 相互作用、透明质酸酶以及循环 ADAMTS 切割片段等方向。文中提到的相关抗体和透明质酸酶既往应用来自其他疾病背景；本文提出其潜在转化价值。

我的讨论（AI enhanced）

1. 文章的整体逻辑与创新性

这篇文章有三个相互关联的层次：基质的组成变化、蛋白聚糖的周转、炎症相关蛋白的滞留。人组织部分较完整地建立了 VCAN/ACAN 的区域差异；遗传小鼠部分支持 ADAMTS5 催化活性对瓣膜稳态具有功能意义；PTX3 部分则解释为什么转录组可能漏掉重要的 ECM 蛋白变化。

方法上的主要价值，是将“一个基因对应一个总蛋白量”的简化观察拆成多个可测层面：可溶性与核心组分、N 端与 C 端肽段、完整蛋白与切割片段、带糖肽段、组织中的空间分布。ACAN、VCAN 和 PTX3 的结果都说明，这些层面不能互相替代。

证据链尚未完全闭合。本文没有在双缺陷小鼠中通过恢复 ADAMTS5 活性、选择性降低 ACAN/VCAN 或阻断 PTX3 滞留来挽救功能，因此尚不能把整条链写成“ADAMTS5 缺失通过某一种 hyalectan，再经 PTX3–CD44，必然导致钙化”。

2. 同一严重病变瓣膜中的区域差异，不等于患者的时间轨迹

人 CAVD 的 NC 与 C 都来自需要手术的严重 AS 瓣膜。NC 是肉眼没有钙化结节的区域，不能直接等同于早期 CAVD 患者，更不能把对照、NC、C 当成同一患者的三个随访阶段。

配对取样减少了患者间差异，是本文很有价值的设计，但它控制的是供体层面的部分差异，并未建立时间先后。不同区域还可能在细胞组成、机械应力、蛋白提取效率和坏损程度上不同。因此，“VCAN 向 ACAN 的阶段转换”适合作为作者模型保留；更直接的结论是严重病变瓣膜内的区域性基质组成差异。

对照也不是健康人群：他们有终末期心衰，且来源中心与病例不同。年龄和性别校正未消除心衰、BMI、中心及其他合并症的潜在影响。疾病状态与中心基本重合，单靠此设计很难分离二者。Figure S10 排除 BAV 后仍相关，支持总体结果不依赖这两例，但无法建立 BAV/TAV 的一致机制。

3. 糖肽丰度变化尚不能单独归因于糖基化修饰机制

一个糖肽信号的变化可以来自：核心蛋白增加、蛋白降解/提取改变、位点占有率改变，或同一位点糖组成比例改变。本文使用总肽量及 TMT 混合参考归一化，但未见针对每个母体蛋白开展完整的糖肽/蛋白校正、位点占有率分析或糖型比例因果实验。

因此，Figure 2 支持“带糖肽的组成发生变化”，并为 ACAN/VCAN 重塑提供额外分子证据；尚不能直接推出某一种 N-糖型通过改变糖链电荷、脂质结合或 VIC 行为驱动疾病。本文重点分析的 N-糖链，也不能替代对糖胺聚糖侧链长度、硫酸化模式或 HA 含量的测量。

若用于二次分析，可优先检验 ACAN-N126/N333、VCAN-N330 等位点在控制母体蛋白丰度后是否仍有独立糖型差异，并核对 TMT 批次、通道、缺失值及配对关系。零值填补和 KNN 均可能影响低丰度糖肽差异，适合做敏感性分析。

4. 比值、分段肽和不同提取组分应一起解释

ACAN/VCAN 是经缩放丰度计算的相对指标，并非已校准的摩尔比。比值升高可能同时包含 ACAN 增加与 VCAN 减少。本文未完整交代 Figure 3 所用 scaling 的精确公式，图中也未提供可直接摘录的精确回归系数和置信区间。跨瓣压差分析只有小规模手术患者、没有外部队列及预测性能评价，故不能直接称为临床诊断或预后指标。

PRM 与发现型质谱的一致性是同一队列的技术交叉验证，不能当成独立患者验证。ACAN C 端显著而 N 端不显著，是必须保留的结果；这种差异提示蛋白加工、片段保留、覆盖度与检测灵敏度等可能性，但并未单独证明某一裂解过程。

PTX3 尤其体现分组分解读的重要性：其在人 NaCl 组分病变/对照上升，GuHCl 组分钙化/非钙化下降。这与作者讨论中 PTX3 更贴近 VCAN-rich 激活基质的描述可以相容，却不适合概括成“随钙化严重程度在所有组织组分持续增加”。

5. ADAMTS5 的遗传证据支持功能作用，但尚不能分配到单一底物

Adamts5Δcat 是全身、发育期即存在的改变，并非成年 VIC 特异、诱导性的干预；其约 10% BAV 表型也提示发育影响。即使排除 BAV，仍不能据此排除三叶瓣发育或全身基质改变的作用。ApoE 缺失同样包含系统性影响。

四组模型及与 ApoE−/− 的比较支持 ADAMTS5 活性缺失在高胆固醇背景下加重病变。两组总胆固醇无显著差异，有助于缩小解释范围；但总胆固醇并不能穷尽脂蛋白组成或免疫状态差异。用“共同作用”“背景依赖的加重”比较稳妥，除有明确交互效应分析外，不宜一律写成严格统计学“协同”。

小鼠同时积聚 VCAN 与 ACAN，并没有直接复制人钙化区 VCAN 下降、ACAN 上升的全部模式；人钙化区 HAPLN1 下降，小鼠部分条件下 HAPLN1 上升，也提示二者是部分病理特征的对应。

**模型更适合研究蛋白聚糖周转失衡、瓣叶增厚、脂质沉积和瓣膜功能障碍。**作者已承认其不完整重现晚期钙化。AS 与 AR 共存、流速变化受血流动力学影响，因而流速升高不能单独代替钙化量或纯狭窄终点。52 周雄鼠“100% disease”也不能写成“100% 出现单纯钙化性狭窄”。

6. 单细胞与体外 VIC 结果提供状态关联，重复层级需明确

Figure 4D 的 scRNA-seq 是公开小鼠数据再分析，并非本研究人瓣膜的单细胞实验，也不是作者新建双缺陷模型的单细胞数据。

本次核对 GSE180278 的 GEO 记录 及其 GSM5457083 样本说明：共有 3 个样本记录，WT、Ldlr−/−、ApoE−/− 分别混合 30、24、19 只小鼠；每种条件为一个混池文库。WT 是 12 周雄鼠、普通饮食；两种高脂血症小鼠终末为 24–26 周，接受 Western diet 16 周。因此，图中细胞分布可用于描述表达状态，不能把细胞或被混合的小鼠直接当作独立测序重复，也无法从这些条件区分基因型、年龄与饮食各自贡献。Acan⁺ 细胞来源比例不宜当成可靠的动物水平差异丰度检验。

人 VIC 使用商业来源、P4–P6，但现有方法未清楚给出独立供体数及每项实验的生物学重复定义。小鼠 VIC 每次由 2–3 只动物混池、使用 P8–P12，需考虑培养选择和传代效应。柱图点数或培养孔数不能自动当成独立供体数。

SPP1 增加说明状态相关表达变化；若要证明稳定的成骨命运及其功能，需要结合矿化、谱系、可逆性等额外证据。CellChat 的 SPP1–CD44 是基于转录表达和数据库的预测，本文未直接阻断该配对或做受体依赖挽救。

7. PTX3 的证据更支持基质相关滞留，而非直接结合与促钙化机制已闭环

人和小鼠组织中，PTX3 蛋白增加而相应转录未明显增加，符合局部滞留增加的解释；但仅凭此组合，仍不能完全区分循环来源、局部其他细胞来源及降解变化。

HA 酶处理使 PTX3 染色下降，说明有 HA 依赖的保留/可检测部分。ITIH1 免疫沉淀共同带下 HA 和 PTX3，支持它们处于相关复合物中。**共同沉淀不等于已测得 PTX3 与 HA 的直接结合，更不等于已证明 ITIH1 的必要性。**作者在讨论中采用 ITIH 重链介导的解释，比摘要里简单的“PTX3 bound to HA”更准确。

透明质酸酶作用在切片上，不是对活体小鼠的疗效干预。信号减少尚不能推导为炎症减轻或瓣膜功能改善。PTX3 在女性小鼠也强烈升高，而 ACAN/VCAN 表型较弱，说明 PTX3 丰度与全部结构病变并非一一对应。

原始未裁剪 WB 有助于核对膜条带、重复检测与 Ponceau 归一化。s07 中说明了部分膜的再次检测及先前条带残留标记；应依据这些标注阅读，不能从一个旧条带标记推断实验失效，也不能把附有原始图当作已经完成定量与原始数据审计。

8. 统计与报告中的局限

人组学使用供体配对和多重检验校正，是值得保留的设计信息。小鼠 Tables S10–S11 及 Figure S8A 使用名义 P 值，不能统一写成 FDR＜0.05。Figure 6A 红点只需在一个年龄显著，故 HAPLN1 等“两个时间点方向一致”不等于“两个年龄均显著”。

52 周雌性蛋白质组每组只有 3 只动物。“雄性显著、雌性不显著”本身不能证明存在正式的性别交互作用。需直接检验 genotype×sex，并结合效应量和区间。

部分 qPCR、组织染色和 IP 的独立供体数没有清晰列出；小鼠 WB 方法写合并两份瓣叶提取物，IP 使用混合人蛋白样本，不能用泳道数替代供体数。补充表大多只有汇总值，现阶段不能复算供体层面检验或完整核对异常值处理。

9. 材料间不一致与待核对项

以下是已看到的原文/材料差异，分别保留出处，不静默统一。

项目	已核实的差异	本笔记的处理
人 PRIDE 编号顺序	用户提供的正文 Methods 将 PXD078618 对应 proteomics、PXD078686 对应 glycoproteomics；数据库实际相反。	数据入口按 PRIDE 的标题、方法与文件类型标注，并保留这条版本差异。
糖蛋白组样本量	Table S5 与 PXD078618 一致为 15/15/15；Table S6 表注却写 29/17/17；补充方法总样本描述也未区分所有子实验。	糖蛋白组按 45 个组织样本记录；S6 的样本表注需要作者澄清。
表格条目数	正文称 141 种显著 N-glycoforms，当前 Table S6 实际有 140 条具名记录，涵盖 13 个基因名称（包含连接蛋白 HAPLN1）；正文概括小鼠蛋白为 239，S10 为 239 条、S11 为 232 条蛋白记录。	结果保留作者报告数，复用时按具体表中的实际可用记录及分类计数；不将 239 当成两个年龄共同覆盖数。
靶向质谱规模	正文、补充方法及 S3 图注为 118 蛋白/210 肽；S3C 流程图写 119 蛋白/221 肽；当前 S7 有 207 行非空 Measured Peptide；方法还将 PRM 列表误指向 Table S4。	正文按作者报告的 118/210，实际结果索引为 Table S7；不推测设计、过滤或修订造成数字差异的具体原因。
NaCl 提取时长	正文 Methods 写 2 h；Figure 2A、S1A、S3C、补充方法及 PRIDE 方法写 1 h。	术语与流程概括按补充方法的 1 h，实际复用实验前需确认。
人 BAV 比例	正文为 2/17，Table S2 为 12.5%；2/17 约 11.8%。	使用正文病例数，不自行假定缺失病例或分母。
12 周雄鼠 n	Figure 5E：WT/Δcat/ApoE/DKO＝8/11/12/18；S6C 图注＝7/10/11/17；Table S8＝10/11/12/17。	各图表用各自分母，不把它们拼成一个统一样本数。
52 周雄鼠 n	Figure 5E 为 7/6/6/8；S6D 与 Table S9 为 8/5/7/8。	同上；需要原始纳入、排除与缺测清单才能核对。
12 周功能异常描述	正文将单缺陷雄鼠写作约 30% AR 或 AR＋AS，将双缺陷写作约 50% AS 或 AR＋AS；Figure 5E 中颜色构成并不完全对应这些文字。	不重建未经提供的精确事件数；结果保留图示构成与明确的 52 周观察。
平均或峰值流速	正文和部分图注使用 mean velocity；S6 坐标及 Tables S8–S9 使用 peak velocity。	表格数值按“峰值流速”记录，复用模型前核对原始超声定义。
12 周蛋白质组分组	正文称没有纳入 WT 与 Adamts5Δcat；Table S10 实际包含这两组的丰度和比较列，表注却只交代 ApoE 与 DKO 各 n＝8。	Figure 6 的定量结论只引用有明确信息的 DKO/ApoE 比较；不忽略表内额外数据。
人 VIC 矿化染色时间	方法写第 21 天茜素红；Figure S4D 标记 D3/D7/D14，图注也写 14 天。	按各自来源保留；不能把 S4D 的图直接称作第 21 天结果。
非还原 PTX3 WB	正文将 S9D 用于讨论所回收 PTX3 的多聚体；S9D 图注及 s07 原始图明确标为 IP 后上清。	图像描述为上清的多聚体信号，不写成非还原沉淀物直接验证。

其他复用前需核对的细节：Figure 3 的回归称为“relative risk regression”，但方法写使用 lm，终点是连续压差、图轴为 β；需要精确公式才能明确模型。Table S2 年龄分布表注、补充方法的 range/IQR 口径并不完全统一。Figure S7 的超声、胆固醇、体重 n 各不相同，且体重合并了历史实验数据；需分别建表。上述报告差异不自动否定全部结果，但影响复现与效应估计。

10. 可以借鉴的方法与后续开放问题

可直接借鉴的是将总蛋白、分段肽、切割产物、局部转录与组织定位联合解释。对于 ECM 分子，先决定测量“总量、完整结构、片段、可提取性还是滞留”，往往比只增加一种组学更重要。

围绕本文证据链，后续最值得讨论的问题是：

1. ACAN/VCAN 比值是否能在有独立供体重复、包含早期病变的队列中重复？控制蛋白提取、细胞组成及临床混杂后是否仍成立？
2. 恢复成年 VIC 中的 ADAMTS5 活性，能否在不改变系统性胆固醇的情况下改善瓣膜功能？这种改善是否需要降低某一特定 hyalectan？
3. ACAN 不同端肽段及糖型的变化，是总蛋白变化、加工变化还是特异糖基化改变？
4. ITIH 介导的 PTX3 滞留是否是必要环节？阻断该过程后，局部炎症、VIC 状态和瓣膜力学是否改变？
5. 在保留基质正常水合和机械功能的前提下，是否能够调节异常周转？本文尚未建立具体干预的方向、窗口或安全性。

这些问题仅围绕当前主文献形成讨论框架，尚未扩展成独立课题方案。

数据公开与相关资源

截至 2026-09-05，本次已读取三个 PRIDE 项目的公开元数据，并核对其方法/数据类型；GEO 的系列文本及样本说明也可访问。

数据	本次核实的对应编号	可用于什么
人 ECM 发现型蛋白质组	PXD078686；PRIDE 元数据	63 个组织样本的 NaCl/GuHCl 分步提取数据、蛋白丰度与片段覆盖。
人完整糖肽组	PXD078618；PRIDE 元数据	45 个组织样本、TMT 批次及位点/糖型复核。
小鼠瓣膜蛋白质组	PXD078502；PRIDE 元数据	核对年龄、性别、基因型及 ECM 蛋白变化。
公开小鼠瓣膜 scRNA-seq	GSE180278；GSM5457083 样本说明	描述 VIC 状态及表达分布；每组混池文库的限制见上文。
正文与补充入口	PubMed；期刊补充材料入口	文献检索与版本追溯；期刊补充网页本次工具访问未成功，实际精读以用户本地附件为准。